陳 煜 凌 霄 余麗梅 邱 振 席加喜

(1 廣西壯族自治區(qū)皮膚病醫(yī)院藥械科，南寧市 530007，電子郵編：752862976@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，南寧市 530021)

順鉑是典型的第一代鉑類藥物，抗腫瘤譜廣，是臨床治療實體瘤最常用的抗腫瘤藥物，被各大指南推薦作為治療肺癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤的一線藥物[1-2]，是乳腺癌等腫瘤多線治療的主要藥物[3]。順鉑的療效顯著，但不良反應較多，常見的不良反應有腎功能損傷、胃腸道反應、骨髓抑制等，其中腎毒性是順鉑劑量限值性毒性，也是限制其臨床應用的主要原因[4]。順鉑所致腎損傷的病理表現(xiàn)為腎小管上皮細胞壞死、變性以及腎間質(zhì)水腫等，但發(fā)生機制目前尚為完全明確，氧化損傷是目前主要研究方向[5]。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖，其主要有效成分有脂溶性和水溶性兩大類，脂溶性成分主要為丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮B 等，水溶性成分主要為丹參素、丹參酸丙、丹酚酸A、丹酚酸B 和原兒茶醛等[6]。丹參水提物和醇提物均具有廣泛的藥理作用。研究表明，丹參提取物具有抗細胞凋亡、抗炎、抗癌、改善血液循環(huán)、抗肝纖維化、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[7-11]。 還有文獻報告，丹參水提物和醇提物對不同類型的腎臟損傷均顯示出一定的改善作用[13-15]，這可能與丹參水提取物和醇提取物具有抗炎、抗氧化和改善微循環(huán)的作用有關(guān)。但鮮見有關(guān)丹參水提物和醇提物對腎損傷改善作用的研究。本研究比較丹參水提物和醇提物對順鉑所致腎損傷的改善效果，為進一步研究丹參藥理作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只成年健康雄性SD大鼠，體重160～180 g，購自廣西醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(桂)2009-0002，試驗動物使用許可證為SYXK桂2009-0004。大鼠飼養(yǎng)于18℃～22℃清潔級動物實驗室內(nèi)，自由飲水進食，正常喂養(yǎng)。

1.2 藥品及試劑 丹參水提物和醇提物由本課題組前期研究制備，方法參照《中華人民共和國藥典2015版一部》[16]中丹參總酚酸提取物(丹參水提取)和丹參酮提取物(丹參醇提取)的方法進行提??；順鉑注射液(齊魯制藥，批號：1020032DB)；氨磷汀注射劑(大連美羅大藥廠，批號：53110301)。

PCR的Marker 100～600 bp(北京TIANGEN公司，批號：MD.101)；PCR擴增引物由生工生物工程上海有限公司設(shè)計并提供；瓊脂糖(西班牙 Biowest 公司，批號：122015)；5×TBE電泳緩沖液(生工生物工程上海有限公司，批號：11064072)。丙二醛(批號：20810117)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px；批號：20180109)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD；批號：2018202)、一氧化氮(批號：20181231)、血肌酐(批號：2018231)、尿素氮(批號：20180118)、尿蛋白(批號： 20181225)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosamidase,NAG；批號：20180208)及胱抑素C(批號：ml003138)檢測試劑盒均購自南京建成生物有限公司。人腎組織腎損傷因子(kidney injury molecule 1, KIM-1)檢測試劑盒購自上海達為科生物科技有限公司(批號：201803)，乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：20180705)，活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：10640920)。

1.3 儀器 PCR儀(Life Technologies公司)；Thermo Forma 725 超低溫冰箱(美國Forma公司)；WH-1微型旋渦混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；5810R型高速冷凍多用途離心機(德國 Eppendorf公司)；BIO-RAD550型酶聯(lián)免疫測定儀(美國Bio-Rad公司)；AX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；721型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 實驗分組 SD大鼠正常喂養(yǎng)2周后，將按其完全隨機法分為空白組、順鉑組、氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組，每組12只。參考前期研究結(jié)果[17]，順鉑組、氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組的大鼠，按200 mg/kg給予1 mg/mL順鉑(順鉑用0.9%氯化鈉注射液配制成1 mg/mL溶液)尾靜脈注射建立大鼠腎損傷模型，空白組注射等量0.9%氯化鈉注射液。從造模后第1天起，氨磷汀對照組組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組分別給予腹腔注射氨磷汀1.0 mg/kg、丹參水提取物(0.5 g/kg，按生藥量計算)、丹參醇提取物(0.5 g/kg，按生藥量計算)，空白組和順鉑組給予腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液，1次/d，連續(xù)21 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 尿液指標：末次給藥后收集大鼠24 h尿液(使用大鼠代謝籠收集)，分別測定尿NAG、24 h尿蛋白，其中NAG采用對硝基酚比色法測定，24 h尿蛋白采用考馬斯亮藍法測定，KIM-1水平采用酶聯(lián)免疫測定法測定，操作按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 血液指標：末次給藥后，采用20%烏拉坦麻醉大鼠后，腹主動脈取血，3 500 r/min離心15 min，取上清液測定血肌酐、尿素氮、胱抑素C的含量及乳酸脫氫酶活性，其中肌酐采用苦味酸法測定，尿素氮采用二乙酰一肟法測定，胱抑素C采用酶聯(lián)免疫吸附法測定， 乳酸脫氫酶活性采用比色法測定，操作按照試劑盒說明書進行。

1.5.3 腎臟組織指標：1.5.2方法取血后，在腎動脈分支以下行腹主動脈插管，夾閉腎動脈分支以上的近心段，剪開左腎靜脈，2℃～4℃生理鹽水原位灌洗腎臟，腎臟顏色由紅變白后，剪下右側(cè)腎臟，并沿中線切開，一份腎組織立即液氮罐保存，用于提取RNA，另一份腎組織勻漿后檢測SOD、丙二醛、GSH-Px、一氧化氮及ROS水平。(1)SOD、丙二醛、GSH-Px、一氧化氮水平檢測：取腎組織，加細胞裂解液勻漿后取上清液，采用黃嘌呤氧化法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，硝酸還原酶法檢測一氧化氮水平，采用分光光度法檢測GSH-Px活性。(2)腎細胞ROS含量檢測：取腎組織勻漿后于冰浴上加磷酸緩沖鹽溶液(0.1 g/mL)制成細胞懸液，1 000 r/min離心10 min洗凈細胞，細胞計數(shù)器計數(shù)，使細胞數(shù)為1×106/mL，接種于6孔黑色接種板，參照ROS試劑盒說明書,放入2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(終濃度為5 μmol/L),于37℃振蕩水浴1 h，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，盡可能除盡游離于培養(yǎng)液中的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽,多功能酶標儀檢測細胞內(nèi)ROS含量,檢測的激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm[15]，讀取A值，各實驗組ROS含量=各實驗組A值/空白組A值[13]。以上實驗重復3次，取均值。(3)腎組織KIM-1、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)mRNA表達檢測：采用實時定量PCR測定腎組織KIM-1、TGF-β1 mRNA表達。① RNA提取。取腎組織(20～30 mg)加入1 mL TRIzol，低溫充分勻漿，加入200 μL氯仿震蕩，室溫靜置5 min， 12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相，分離至新無RNA 酶的EP管。加入異丙醇0.5 mL，充分混勻，室溫靜置30 min， 4℃，12 000 r/min離心10 min，沉淀加入預冷的75%乙醇1 mL，4℃，7 500 r/min 離心5 min，去除上清液，沉淀自然風干，沉淀加入30 μL 焦碳酸二乙酯水溶解得總RNA溶液，取5 μL總RNA溶液加1 μL溴酚藍混勻進行電泳后，凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，無雜帶提示RNA純度好，可用于反轉(zhuǎn)錄為cDNA。② 實時定量PCR檢測KIM-1、TGF-β1 mRNA表達水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參進行實時定量PCR 。PCR反應體系：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Taq Mix 12.5 μL，用蒸餾水補充至體積為25 μL。反應條件：94℃預變性5 min；退火56℃ 50 s，延伸72℃ 30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取實時定量PCR產(chǎn)物進行電泳，電泳條件為100 V，23 min，于凝膠成像分析系統(tǒng)圖像分析軟件作光密度測定，目的基因mRNA的相對表達量=目的基因條帶光密度/GAPDH條帶光密度。引物序列設(shè)計參考文獻[12]，見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以(x±s)表示，采用方差分析進行比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠24 h尿蛋白和尿NAG、KIM-1水平比較 與空白組比較，其余4組大鼠24 h尿蛋白、尿NAG及KIM-1水平均升高(均P<0.05)。與順鉑組比較,氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組大鼠24 h尿蛋白、尿NAG 及KIM-1水平均降低(均P<0.05)。丹參醇提取物組大鼠24 h尿蛋白、尿NAG 及KIM-1水平均低于氨磷汀對照組和丹參水提取物組(均P<0.05)。見表2。

表2 5 組大鼠尿液指標比較(x±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與丹參醇提取物組比較，cP<0.05。

2.2 5組大鼠血肌酐、尿素氮、胱抑素C、乳酸脫氫酶水平比較 與空白組比較，其余4組大鼠血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平、乳酸脫氫酶活性均升高(均P<0.05)；與順鉑組比較,氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組大鼠血液肌酐、尿素氮、胱抑素C水平、乳酸脫氫酶活性均降低(均P<0.05)；丹參醇提取物組血肌酐、尿素氮、胱抑素C水平以及乳酸脫氫酶活性均低于氨磷汀對照組和丹參水提取物組(均P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血液中肌酐、尿素氮、胱抑素C、乳酸脫氫酶水平比較(x±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與丹參醇提取物組比較，cP<0.05；氨磷汀對照組刪除1例胱抑素C水平異常值，納入11例進行分析。

2.3 5組大鼠腎組織SOD、丙二醛、GSH-Px、一氧化氮水平比較 與空白組比較，其余4組大鼠腎組織丙二醛、一氧化氮水平升高，SOD、GSH-Px水平降低(均P<0.05)；與順鉑組比較,氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組大鼠腎組織丙二醛、一氧化氮水平降低(均P<0.05)，SOD、GSH-Px水平升高(均P<0.05)；與丹參醇提取物組比較，氨磷汀對照組和丹參水提取物組大鼠腎組織丙二醛、一氧化氮水平升高，SOD、GSH-Px水平降低(均P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠腎組織SOD、丙二醛、GSH-Px、一氧化氮水平比較(x±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與丹參醇提取物組比較，cP<0.05。

2.4 5大鼠腎組織ROS水平比較 與空白組比較，其余4組大鼠腎組織中ROS水平增高(均P<0.05)；與順鉑組比較，氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組大鼠ROS水平降低(均P<0.05)；與丹參醇提取物組比較，氨磷汀對照組、丹參水提取物組大鼠ROS水平升高(均P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠腎組織勻漿ROS測定結(jié)果(x±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與丹參醇提取物組比較，cP<0.05。

2.5 5組大鼠KIM-1和TGF-β1 mRNA表達水平比較 5組大鼠KIM-1 mRNA表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但TGF-β1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組比較，順鉑組、氨磷汀對照組、丹參水提取物組大鼠腎組織KIM-1 mRNA表達水平升高(均P<0.05)；與順鉑組比較，氨磷汀對照組、丹參水提取物組、丹參醇提取物組大鼠KIM-1 mRNA表達水平降低(均P<0.05)；氨磷汀對照組與丹參水提取物組大鼠KIM-1 mRNA表達水平高于丹參醇提取物組(均P<0.05)。 見表6。

表6 5組大鼠KIM-1、TGF-β1 mRNA相對表達水平比較(x±s)

注：與空白組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與丹參醇提取物組比較，cP<0.05。

3 討 論

順鉑所致腎損傷是臨床上常見的藥物不良反應，目前通常采用大量水化的方法以促進順鉑排泄，減少體內(nèi)蓄積而降低腎毒性。但對于心力衰竭或者腎功能不全患者不宜采用水化法，只能選擇其他藥物替代順鉑，這嚴重限制了順鉑的臨床應用。丹參是唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖，有效成分復雜且藥理作用廣泛，具有抗細胞凋亡、抗炎、改善血循環(huán)等多種藥理作用。丹參脂溶性和水溶性成分不同[18-19]，但有研究表明，丹參水溶性成分和脂溶性成分均對各類原因引起的腎損傷具有改善作用[13-15]。

血肌酐、尿素氮、胱抑素C和尿液NAG、24 h尿蛋白常用于評估腎功能，乳酸脫氫酶濃集于腎臟，其活性高低可間接地反映腎細胞損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)丹參水提取物和醇提取物干預后順鉑致腎損傷大鼠的以上腎功能指標均有所改善，提示其對順鉑腎損傷大鼠具有保護作用。此外，經(jīng)丹參水提取物和醇提取物干預后，順鉑致腎損傷大鼠ROS、丙二醛、一氧化氮水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，提示丹參提取物能降低順鉑腎損傷大鼠體內(nèi)的氧化水平。

KIM-1是存在于腎臟近端小管上皮細胞的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是目前臨床急性腎小管損傷早期標志之一，在急性腎損傷的腎小管上皮細胞中高表達，并呈時間依賴性，且具有很高的敏感性和特異性。本研究結(jié)果顯示，丹參水提取物和醇提取物可降低順鉑腎損傷大鼠尿液及腎組織KIM-1 mRNA表達。TGF-β1為一種極強促腎間質(zhì)纖維化物質(zhì)，可反映細胞外基質(zhì)代謝、胞內(nèi)炎癥反應程度，間接反映腎間質(zhì)纖維化情況[20]。而本研究結(jié)果提示丹參水提取物和醇提取物對TGF-β1的表達并無明顯影響，是否提示順鉑所致腎損傷可能與腎纖維化無關(guān)，但還有待相關(guān)研究證實。本研究結(jié)果還顯示，丹參醇提物組的腎功能指標、氧化反應指標、尿及腎組織KIM-1水平均優(yōu)于水提取物組，提示丹參醇提物對順鉑所致腎損傷大鼠的保護作用及降低氧化水平作用均優(yōu)于丹參水提取物。分析其原因可能是水提物和醇提物中丹參酮Ⅱ-A和丹參多酚酸的含量不同，而這兩種單體是丹參藥理作用的重要物質(zhì)，其含量差異可能影響其藥理作用，但仍需要進一步研究加以證實。

氨磷汀為一種有機硫化磷酸化合物，在組織中被與細胞膜結(jié)合的堿性磷酸酶水解脫磷酸后，成為具有活性的代謝產(chǎn)物WR-1065，其化學結(jié)構(gòu)式為H2N-(CH2)3-NH-(CH2)2-SH，因巰基具有清除組織中自由基的作用，可以減輕化療藥物所產(chǎn)生的腎臟、骨髓、心臟毒性，且不影響化療療效。本研究結(jié)果表明，丹參醇提物在改善腎功能和降低氧化反應的作用均優(yōu)于氨磷汀。提示丹參醇提取物除了通過降低氧化應激水平起到改善順鉑致腎損傷大鼠的腎功能外，還可能通過其他分子機制起到腎保護作用，但具體機制還需進一步研究。

綜上所述，丹參水提物和醇提物均能改善順鉑致腎損傷大鼠的腎功能，且醇提物效果更好，其機制可能與降低腎損傷大鼠體內(nèi)氧化應激水平和下調(diào)KIM-1表達有關(guān)。