王 松，李成輝，王洪彩，李明月，劉 彤，劉 軍

(1. 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 德州 251200； 2.東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院，哈爾濱 150030)

大豆肽是豆粕或大豆分離蛋白(SPI)經(jīng)水解或微生物發(fā)酵獲得的不完全水解蛋白產(chǎn)物，是低相對分子質(zhì)量肽的混合物。近年來研究[1]表明，大豆肽能改善大豆蛋白的物理功能性質(zhì)(如溶解性提高，黏性降低，抗凝膠性增強等)，且具有良好的抗氧化、調(diào)節(jié)血脂水平、降血壓、提高免疫、抗癌、增強運動員肌肉和恢復疲勞等特性。因此，大豆肽產(chǎn)品能應用于乳制品、肉類、飲料以及嬰兒食品中，在食品蛋白質(zhì)輔料加工方面有著特殊意義[2]。但因為原料中含有微量的呈色物質(zhì)(如皂苷、色素和異黃酮等)，以及豆粕中糖類在高溫下的焦糖化反應，大豆肽呈現(xiàn)灰黃色，這會影響食品色澤，降低消費者購買欲，從而局限了其在食品工業(yè)中的應用。

工業(yè)常用的大豆肽脫色方法是吸附脫色法，包括陰離子交換樹脂脫色、活性炭脫色、白土脫色等。其中，最常用的脫色劑是活性炭，脫色率為50%以上[3]。但活性炭對大分子物質(zhì)的吸附力不夠，對疏水性物質(zhì)吸附效果差；且價格較高及不易再生，提高了生產(chǎn)成本。與活性炭相比，硅藻土除了具有良好的吸附功能，還具有資源豐富、價格低廉等優(yōu)勢。硅藻土在飲料、啤酒、白糖等食品的生產(chǎn)工藝中被作為脫色劑廣泛應用[4-6]，但還沒有應用在大豆肽脫色工藝中的報道。

然而，硅藻土在吸附呈色物質(zhì)的同時也會吸附氨基酸，使大豆肽中的氨基酸含量下降，影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此，在脫色的同時，保證大豆肽中氨基酸的低損耗是硅藻土脫色工藝的關(guān)鍵。不同氨基酸分子中含有的氨基(—NH)和羧基(—COOH)數(shù)目不同，所以其等電點各不相同。硅藻土的表面電荷也會根據(jù)溶液的酸堿度變化而不同，在酸性條件下，硅藻土的羥基會被質(zhì)子化，表面帶正電荷，此時的硅藻土與表面帶正電荷的氨基酸相互排斥，與帶負電荷的氨基酸相互吸引；反之，當溶液pH大于7時，硅藻土排斥帶負電荷的氨基酸[6]。因此，通過調(diào)控溶液的pH可以在一定程度上控制氨基酸的損耗率。

本研究選用硅藻土為脫色劑，針對大豆肽顏色深的問題，研究pH、溫度、時間及硅藻土添加量對大豆肽脫色的影響，在不改變原始大豆肽生產(chǎn)工藝的同時，創(chuàng)建新的大豆肽脫色工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆分離蛋白粉(蛋白質(zhì)含量92%)，中性蛋白酶(酶活≥20萬U/g)，堿性蛋白酶(酶活≥40萬U/g)，硅藻土(食品級)，無水CuSO4、HCl、KNaC4H4O6·4H2O、NaOH均為分析純，標準蛋白溶液(5.0 mg/mL)。

712E型可見光分光光度計，恒溫水浴鍋，超低溫冷凍儲存箱，電子天平，F(xiàn)E28酸度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆肽的制備

大豆分離蛋白粉用去離子水稀釋至10%，調(diào)節(jié)pH到6.7，加入0.02%中性蛋白酶作用15 min后，85℃滅菌。將滅菌的溶液置于55℃水浴加熱，待溶液達到55℃，將0.3%堿性蛋白酶和0.18%中性蛋白酶同時加入溶液中，酶解50 min。然后將溶液于90℃水浴中滅酶15 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為大豆肽溶液，待用。

1.2.2 大豆肽的脫色

取100 mL大豆肽溶液，加入一定量硅藻土，用1 mol/L氫氧化鈉溶液和1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH，置于一定溫度的恒溫水浴中，磁力攪拌一定時間后，取出用紗布過濾，得到大豆肽脫色液。

1.2.3 脫色率的計算

以去離子水為參照，在400 nm波長下測定未經(jīng)脫色的大豆肽溶液和大豆肽脫色液的吸光度，按下式計算脫色率[7]。

式中：A0為未脫色的大豆肽溶液的吸光度；A為大豆肽脫色液的吸光度。

1.2.4 蛋白質(zhì)損耗率的計算

1.2.4.1 蛋白質(zhì)含量測定

采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量。1.5 g無水硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶解于500 mL水中，邊攪拌邊加入300 mL 10% NaOH溶液，再加入去離子水定容至1 L，配制成雙縮脲試劑，避光保存于塑料瓶中[8]。

取12支試管均分為兩組，每組分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的標準蛋白溶液。用蒸餾水補充至1 mL，再分別加入4 mL雙縮脲試劑，振蕩混勻后，在室溫(20～25℃)下放置30 min。以不加標準蛋白溶液的試樣為參照，在540 nm波長下測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線以及樣品溶液的吸光度計算樣品的蛋白質(zhì)含量[9]。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)損耗率的計算

按照下式計算蛋白質(zhì)損耗率[10]。

蛋白質(zhì)損耗率=m/M×100%

式中：m為大豆肽脫色液中減少的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；M為未脫色的大豆肽溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對脫色效果的影響

5份100 mL大豆肽溶液，分別加入15 g/L硅藻土，將pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，在50℃恒溫水浴30 min，取出后過濾得脫色液，計算脫色率與蛋白質(zhì)損耗率，結(jié)果見圖1。

圖1 pH對大豆肽脫色率及蛋白質(zhì)損耗率的影響

從圖1可以看出，隨著pH的增加，脫色率逐漸減小，說明在此范圍內(nèi)pH越高脫色效果越差。硅藻土屬于極性吸附，酸性條件下，硅藻土表面電荷由負電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾桑藭r對帶有負電荷的顏色物質(zhì)和雜質(zhì)有強吸附性，且隨著pH的降低，表面電位增大，吸附量也隨之變大。并且，本試驗采用的硅藻土具有飽和度隨pH減小而增大的特性，即飽和度越大，吸附量也越大[11]。

當溶液pH為4.0～6.0時，蛋白質(zhì)損耗率顯著增加。這主要取決于大豆肽溶液中氨基酸的種類和含量。不同氨基酸等電點不同，根據(jù)20種氨基酸的等電點特征分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)氨基酸的等電點在pH 5～7之間，只有天冬氨酸和谷氨酸等電點低于4，賴氨酸、組氨酸和精氨酸等電點高于7。當溶液的pH低于某些氨基酸的等電點時，這些氨基酸帶正電荷，會更容易被帶負電荷的硅藻土吸附；而當酸度達到一定程度，硅藻土帶正電荷且大多數(shù)氨基酸也帶正電荷，它們會互相排斥，蛋白質(zhì)的損耗率降低；當酸度過高時，蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此，選擇pH 4.0～6.0作為正交試驗的因素水平。

2.1.2 硅藻土添加量對脫色效果的影響

5份100 mL大豆肽溶液，分別按5、10、15、20、25 g/L加入硅藻土，調(diào)節(jié)pH至6.0，置于50℃恒溫水浴30 min，取出后過濾得脫色液，計算脫色率與蛋白質(zhì)損耗率，結(jié)果見圖2。

圖2 硅藻土添加量對大豆肽脫色率及蛋白質(zhì)損耗率的影響

從圖2可以看出：當硅藻土添加量為5～15 g/L時，脫色率隨硅藻土添加量的增加而提高；當硅藻土添加量高于15 g/L，脫色率開始減小。這是因為在一定程度上提高溶液中硅藻土的濃度，硅藻土吸附色素的活性點增加，相對脫色能力增強[12]。但是，當硅藻土的吸附量高于顏色物質(zhì)總量時，硅藻土本身產(chǎn)生的微量顏色物質(zhì)會提高吸光度，使脫色率下降。當硅藻土添加量超過15 g/L，蛋白質(zhì)損耗率顯著提高。綜合考慮，選擇硅藻土添加量10～20 g/L作為正交試驗的因素水平。

2.1.3 溫度對脫色效果的影響

5份100 mL大豆肽溶液，各加入15 g/L硅藻土，調(diào)節(jié)pH至6.0，分別在30、40、50、60、70℃下恒溫水浴30 min，取出后過濾得脫色液，計算脫色率與蛋白質(zhì)損耗率，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對大豆肽脫色率及蛋白質(zhì)損耗率的影響

從圖3可以看出：溫度在30～50℃之間時，溫度越高脫色率越大；當高于50℃時，脫色效果隨溫度升高逐漸降低。這主要是因為溫度升高，分子的運動加快，硅藻土與顏色物質(zhì)的分子活性隨之提升，脫色劑的吸附能力增大；當溫度過高時，顏色物質(zhì)的分子活性大于硅藻土吸附力，使有色分子從硅藻土的吸附中脫離出來，溶液顏色變深[13]，并且過高的溫度會使某些氨基酸發(fā)生脫氨反應，破壞大豆肽的營養(yǎng)價值。隨溫度的升高，蛋白質(zhì)損耗率也在逐步增大。因此，選擇溫度40～60℃作為正交試驗的因素水平。

2.1.4 時間對脫色效果的影響

5份100 mL大豆肽溶液，各加入15 g/L硅藻土，調(diào)節(jié)pH至6.0，在50℃下分別恒溫水浴10、20、30、40、50 min，取出后過濾得脫色液，計算脫色率與蛋白質(zhì)損耗率，結(jié)果見圖4。

圖4 時間對大豆肽脫色率及蛋白質(zhì)損耗率的影響

從圖4可以看出，隨時間的延長脫色率逐漸提升。主要是由于硅藻土需一定時間達到飽和吸附量，延長時間，可以讓硅藻土充分吸附顏色物質(zhì)；但當吸附量達到飽和后，如繼續(xù)延長時間易造成色素解吸，色度回升[12]。另外，時間延長也會造成蛋白質(zhì)損耗率的增加。因此，選擇時間30～50 min作為正交試驗的因素水平。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇硅藻土添加量、溫度、時間和pH為因素，以脫色率為指標，進行正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表2可知，影響硅藻土對大豆肽脫色效果的因素主次順序為pH>時間>溫度>硅藻土添加量，最佳因素水平組合為A2B2C2D3，即pH 5.0、硅藻土添加量15 g/L、溫度50℃、時間50 min。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 驗證試驗

在最佳脫色條件下進行驗證試驗，大豆肽脫色率達到60.5%，蛋白質(zhì)損耗率為4.2%。脫色大豆肽的蛋白質(zhì)含量達到87.8%，顏色為乳白色。

3 結(jié) 論

大豆肽的硅藻土脫色最佳工藝條件為：硅藻土添加量15 g/L，溫度50℃，時間50 min，pH 5.0。在最佳工藝條件下，脫色率達到60.5%，蛋白質(zhì)損耗率僅為4.2%。脫色后大豆肽的蛋白質(zhì)含量達到87.8%，顏色由灰黃色變?yōu)槿榘咨Ｔ摴に嚳梢詽M足對大豆肽脫色效果的要求，保證脫色后大豆肽的營養(yǎng)價值。