蘇艷玲，張謹(jǐn)華

(晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030619)

在我國(guó)，海帶有著悠久的食用傳統(tǒng)，在許多古代醫(yī)學(xué)典籍中都有提及[1]，它是人們喜食的一種經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值兼具的多年生海藻食物，生長(zhǎng)環(huán)境特殊，代謝物質(zhì)獨(dú)特，多分布于熱帶、溫帶的低溫海域中。近年來(lái)，隨著對(duì)海洋資源的不斷開(kāi)發(fā)，已有部分學(xué)者從海藻中分離得到多種可清除體內(nèi)自由基、具有抗氧化作用的海藻活性物質(zhì)[2]，如裙帶菜多肽、海藻多酚等[3]。海帶多酚是以間苯三酚為結(jié)構(gòu)單元的聚合物，是一類重要的褐藻多酚化合物，褐藻多酚具有較好的抗氧化和抑菌作用，作為天然食品添加劑(抗氧化劑、防腐劑)應(yīng)用于食品中。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多酚的提取方法主要使用溶劑萃取法、閃式提取法、生物酶解提取法、樹(shù)脂吸附提取法、超臨界提取法、超聲波輔助提取方法等[4-8]，這些方法中，超聲波輔助提取方法由于操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、提取率高等特點(diǎn)而被廣泛用于植物多酚的提取，即在一定溫度下超聲波機(jī)械震動(dòng)，使細(xì)胞壁破碎，內(nèi)容物流出，與提取劑充分接觸發(fā)生反應(yīng)[9]。提取工藝條件的優(yōu)化對(duì)于原料的最大利用起著重要的作用。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化海帶中多酚的提取工藝，并通過(guò)測(cè)定海帶多酚清除 DPPH 自由基及ABTS 能力，分析其抗氧化活性，旨在為海帶的綜合利用提供一定的依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料、試劑與儀器

海帶：采購(gòu)于晉中市榆次區(qū)田森超市，購(gòu)買(mǎi)回來(lái)后用水將海帶洗凈并用烘箱烘干至恒重，粉粹并用不同目數(shù)的篩子篩分，收集不同粒度的顆粒備用。無(wú)水乙醇(分析純)：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；沒(méi)食子酸、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

JP-040型超聲波清洗機(jī) 廣東廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；EV-2600型紫外可見(jiàn)光分光光度 上海昂拉儀器有限公司；MJ-BL35F31攪拌機(jī) 美的生活電器制造有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海帶多酚的提取及多酚含量的測(cè)定[10]

稱取1 g海帶粉末于小燒杯中，加入乙醇進(jìn)行超聲處理，結(jié)束后取出燒杯，對(duì)超聲后的液體進(jìn)行抽濾處理，得清液。取1 mL清液，滴入3 mL福林酚并混勻，5 min后再滴入6 mL 7.5% NaCO3混勻，定容至25 mL，室溫下，暗處放置2 h，于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以沒(méi)食子酸味為標(biāo)準(zhǔn)品得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.1815x+0.05(R2=0.9908)，進(jìn)而可得多酚質(zhì)量濃度，代入下式即可計(jì)算出多酚的提取率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)1.2.2.1 物料粒度

稱取不同粒度(10，30，50，70，90目)海帶粉末1 g，加入25 mL 70%的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察物料粒度對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入25 mL不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察不同乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.2.3 料液比

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入1.2.2.2確定濃度的不同體積分?jǐn)?shù)(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察料液比對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.2.4 溫度

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入1.2.2.2確定濃度的乙醇，按照1.2.2.3確定的料液比加入乙醇，在不同溫度(30，40，50，60，70 ℃)下超聲30 min，考察溫度對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.2.5 提取時(shí)間

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入確定濃度的乙醇，按照1.2.2.3確定的料液比加入乙醇，在1.2.2.4確定的溫度下，考察不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50 min)對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，選取超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度4個(gè)因子為自變量，以海帶多酚提取率作響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)做四因素三水平的響應(yīng)面分析，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。試驗(yàn)因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of central combination test design

1.2.4 海帶多酚對(duì)DPPH自由基清除作用

參照文獻(xiàn)[11,12]的方法。準(zhǔn)確移取 0.2 mL 樣品液于試管中，加入 2.8 mL 0.05 mg/mL DPPH，充分混勻，37 ℃水浴靜置 30 min 后測(cè)定 517 nm下吸光度 A1(以無(wú)水乙醇為參比)；同時(shí)測(cè)定 DPPH 溶液與無(wú)水乙醇混合后的吸光度 A0，以及樣液與無(wú)水乙醇混合后的吸光度 A2。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.5 海帶多酚對(duì)ABTS清除作用

參照文獻(xiàn)[13,14]的方法。將7 mmol/L的ABTS溶液5 mL與140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀 88 μL混合，制備ABTS+自由基儲(chǔ)備液，避光反應(yīng) 24 h，使用前用無(wú)水乙醇將儲(chǔ)備液稀釋至吸光度0.70±0.02(734 nm)，即得ABTS+·稀釋液。取4.8 mL ABTS+·稀釋液與 0.2 mL 稀釋至適當(dāng)濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應(yīng) 15 min，以無(wú)水乙醇作參比在 734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 Ai；以等體積的無(wú)水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測(cè)定吸光度 A0；以等體積的無(wú)水乙醇溶液代替 ABTS+·溶液，同法操作，測(cè)定吸光度 Ai0。

ABTS+·清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 19.0 及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析及顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)開(kāi)展不同因素(物料粒度、乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間)對(duì)海帶多酚提取率的影響研究，結(jié)果見(jiàn)圖1(a～e)。

圖1 各因素對(duì)海帶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of each factor on the extraction rate of kelp polyphenols

由圖1中a可知，隨著海帶粉碎粒度的加大，多酚提取率呈不斷上升趨勢(shì)，在70目時(shí)達(dá)到最大值，然而超過(guò)70目后海帶多酚的提取率逐漸減小。這說(shuō)明物料粒度對(duì)多酚提取率會(huì)造成一定的影響，粒度越大，粉碎不徹底，不能將細(xì)胞破碎，內(nèi)容物相對(duì)溶出的量較少而使提取率較低，粒度越小，顆粒越細(xì)，超聲時(shí)細(xì)胞越容易破碎，與溶劑接觸的相對(duì)表面積就越大，從而使多酚的提取率增高，但并不是粒度越細(xì)提取率越好，粒度過(guò)細(xì)會(huì)造成結(jié)塊現(xiàn)象，同時(shí)還會(huì)給后續(xù)的抽濾帶來(lái)一定的影響。因此，物料粒度70目為最佳值。

由圖1中b可知，海帶多酚提取率隨乙醇濃度的增大而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，由于乙醇濃度的增加，導(dǎo)致溶液極性增強(qiáng)，符合相似相溶原理，之后可能由于其余化學(xué)物質(zhì)的溶出，抑制了多酚類物質(zhì)的溶解而使提取率減少[15]。因此，乙醇濃度70%為最佳值。

由圖1中c可知，隨著料液比的增大，海帶多酚的提取率不斷升高，當(dāng)料液比大于1∶25以后，乙醇濃度的增加并沒(méi)有使多酚的提取率持續(xù)上升而是趨于平穩(wěn)狀態(tài)，說(shuō)明得到的多酚溶液已經(jīng)趨于飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加溶劑的體積可能會(huì)導(dǎo)致多糖等物質(zhì)溶出[16]，并且給后期溶劑的處理與回收帶來(lái)一定的負(fù)擔(dān)。因此，料液比1∶25為最佳值。

由圖1中d可知，隨著超聲溫度的提高，在30～60 ℃之間，多酚提取率逐漸增大，在60 ℃海帶多酚提取率達(dá)最大值，之后明顯下降，可能是高溫使得多酚類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞[17]，而使多酚提取率下降。因此，超聲溫度60 ℃為最佳值。

由圖1中e可知，海帶多酚提取率隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，在40 min時(shí)達(dá)最大值，提取時(shí)間變長(zhǎng)，多酚可充分地溶出，使得提取率升高；當(dāng)超過(guò)某一時(shí)間，多酚的提取率有所下降，可能與長(zhǎng)時(shí)間超聲作用使得海帶中其他物質(zhì)抑制多酚的溶出，使多酚提取率變低。因此，超聲時(shí)間40 min為最佳值。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，根據(jù)表 1設(shè)計(jì)的自變量因素超聲溫度(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、乙醇濃度(D)與海帶多酚提取率的提取工藝參數(shù)回歸模型組合，對(duì)表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：Y=2.11+0.092A+0.14B+0.23C+0.14D+8.05×10-3AB-0.054AC-0.14AD-0.12BC+0.071BD-0.059CD-0.22A2-0.25B2-0.28C2-0.23D2，方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equations

注：當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異顯著，用“*”表示；當(dāng)P<0.01時(shí)，表示差異極顯著，用“**”表示。

由方差分析結(jié)果可知，回歸模型P<0.0001，表明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P為0.6728>0.1，不顯著，表明模型與試驗(yàn)擬合度較好，回歸模型的決定系數(shù)為R2=0.9289，校正系數(shù)RAdj2=0.8578，說(shuō)明該模型誤差較小，可視為允許誤差，能夠?qū)?2.89%的響應(yīng)值變化進(jìn)行有效合理解釋，模型的可信度高。因此，可用此方程模型確定超聲輔助乙醇提取海帶多酚工藝參數(shù)的分析和預(yù)測(cè)。

由方差顯著性檢測(cè)分析可知，B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，說(shuō)明它們對(duì)海帶多酚的提取率有顯著影響，A及交互項(xiàng)AD、BC的P<0.05，說(shuō)明它們之間差異顯著。由F值大小可知，4個(gè)因素中對(duì)海帶多酚提取率的影響為C>D>B>A。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件做出各因素之間交互作用的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，用來(lái)反映各組以海帶多酚提取率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖，見(jiàn)圖 2(a～f)。響應(yīng)面圖中響應(yīng)面坡度的陡峭程度及等高線的稀疏程度可直觀反映出試驗(yàn)因素兩兩交互作用的顯著程度，越陡峭說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)操作條件的改變?cè)矫舾衃18,19]，等高線呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著，呈圓形時(shí)則表示兩因素交互作用不顯著。

圖2 各因素交互作用對(duì)海帶多酚提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours of the interaction of various factors on the extraction rate of kelp polyphenols

由圖2中c可知，響應(yīng)面圖較陡峭，說(shuō)明兩因素交互作用顯著，當(dāng)溫度固定時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，海帶多酚的提取率呈逐漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明適當(dāng)加大乙醇濃度有利于多酚物質(zhì)的溶出；當(dāng)乙醇濃度固定時(shí)，適當(dāng)提高提取溫度可加快海帶多酚的溶出速度，等高線中乙醇濃度曲線變化密集程度高，說(shuō)明乙醇濃度比溫度對(duì)多酚提取率的影響大。由圖2中d可知，提取時(shí)間曲面變化比較陡峭，同時(shí)等高線中的曲線變化密集程度高，因此，提取時(shí)間比料液比對(duì)多酚提取率的影響大。由圖2中a可知，料液比較溫度的曲線密集，說(shuō)明料液比對(duì)多酚提取率的影響大。由圖2中b可知，提取時(shí)間較溫度多酚提取率的影響大。由圖2中e可知，乙醇濃度較料液比對(duì)多酚提取率的影響大。由圖2中f可知，提取時(shí)間較乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響大。

應(yīng)用軟件分析得出用乙醇作提取劑，超聲輔助提取海藻多酚的最佳工藝條件為：超聲溫度64.18 ℃、料液比1∶27.5(g/mL)、超聲時(shí)間43.9 min，乙醇濃度73.7%，此條件下海帶多酚提取率預(yù)測(cè)值為2.139 mg/g。考慮實(shí)際操作的方便性，對(duì)這些參數(shù)稍作調(diào)整，確定超聲溫度65.0 ℃、料液比1∶28、超聲時(shí)間45 min，乙醇濃度75%，對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得海帶多酚提取率為2.118 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可信。

2.3 海帶多酚抗氧化活性

2.3.1 海帶多酚對(duì) DPPH 自由基清除作用

多酚物質(zhì)是具有抗氧化、抗衰老等功效的一種重要的生物活性物質(zhì)，其活性大小與多酚含量密切相關(guān)，DPPH自由基清除率是反映其活性的重要指標(biāo)。以不同濃度的Vc溶液對(duì)DPPH自由基、ABTS的清除率為對(duì)照，研究不同濃度下海帶多酚清除DPPH自由基及ABTS的變化規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 海帶多酚及Vc對(duì)DPPH和ABTS自由基清除率的影響Fig.3 The effect of kelp polyphenols and Vc on the scavenging rates of DPPH and ABTS free radicals

海帶多酚對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而升高，至180 μg/mL時(shí)，達(dá)最大值68.87%，在0～180 μg/mL之間，多酚濃度對(duì)DPPH清除率擬合線性方程為y=8.7836x+12.57，相關(guān)系數(shù)R2=0.9822，通過(guò)擬合方程算出清除率的IC50=81.119 μg/mL。

2.3.2 海帶多酚對(duì)ABTS清除作用

由圖3 可知，隨著海帶多酚濃度的增大，對(duì)ABTS自由基清除率呈上升趨勢(shì)，兩者之間表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，在210 μg/mL時(shí)ABTS清除率最大，為49.73%，在0～210 μg/mL范圍內(nèi)，海帶多酚濃度對(duì)ABTS清除率擬合線性方程為y=5.573x+7.7579，相關(guān)系數(shù)R2=0.9867，通過(guò)擬合方程算出清除率的IC50=222.224 μg/mL，可見(jiàn)海帶多酚具有一定的ABTS清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以海帶為研究試材，探究了影響超聲提取海帶多酚的因素，在單因素的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多酚提取工藝，并確定最佳工藝條件為：超聲溫度65.0 ℃、料液比1∶28(g/mL)、超聲時(shí)間45 min，乙醇濃度75%，在此條件下海帶多酚提取率為2.118 mg/g，接近模型預(yù)測(cè)值2.139 mg/g。通過(guò)測(cè)定海帶多酚對(duì) DPPH 自由基和ABTS的清除率可知，其清除能力與多酚濃度之間呈一定的正相關(guān)關(guān)系，清除率分別為68.87%和49.73%，相應(yīng)的IC50為81.119 μg/mL和222.224 μg/mL，由此可知，海帶多酚具有一定的體外抗氧化能力，陳浩南等的研究也發(fā)現(xiàn)，高良姜水提物中多酚含量較高，具有較好的ABTS和DPPH 自由基清除能力[20]。