劉曉飛，鄭志輝，宋潔，劉美茜，關(guān)樺楠，張娜，王薇

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

色素又被稱(chēng)為色階、著色劑等，是食品添加劑的重要組成部分[1]。食品的顏色對(duì)吸引消費(fèi)者和評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量起著重要的作用[2]。色素可以增加食品的色澤、延長(zhǎng)食品的貯藏時(shí)間，是決定食品質(zhì)量的重要因素之一[3,4]。色素分為天然色素和合成色素。近年來(lái)的研究表明合成色素有毒性，進(jìn)入人體后會(huì)使染色體斷裂，使細(xì)胞死亡并失去輸氧能力[5]，而天然色素因安全可靠、無(wú)毒副作用且可提供營(yíng)養(yǎng)而被人們廣泛關(guān)注。天然色素可從各種植物、動(dòng)物、微生物等中提取。微生物色素的生產(chǎn)具有來(lái)源廣、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。放線菌是色素的主要來(lái)源，放線菌色素包括放線紫素、石蕊殺菌素和花青素等[6-8]，其色素多用作抗生素、營(yíng)養(yǎng)劑和食品保護(hù)劑[9]，還可用作抑菌劑及多種食品的著色劑等[10]。因此，放線菌產(chǎn)生的色素對(duì)食品行業(yè)具有重要的作用和意義。

土壤是放線菌篩選的重要來(lái)源，不同的、獨(dú)特的地容地貌為新型放線菌的篩選提供了更多的選擇。Gan Renyou 等[11]從食用豆皮的提取物中發(fā)現(xiàn)了原花青素，且原花青素表現(xiàn)出高抗菌和抗氧化作用。Domenico Carminati等[12]在芝士工廠篩選到了產(chǎn)藍(lán)色素的假單胞菌并且以此為指標(biāo)控制奶酪變質(zhì)。Selvakumar Dharmaraj等[13]從白花海綿狀愈傷組織中分離到白色系鏈霉菌(AQBWWS1)，經(jīng)熒光白光發(fā)酵后產(chǎn)生食品級(jí)色素(類(lèi)胡蘿卜素)。本實(shí)驗(yàn)從東北寒地黑土中分離篩選出產(chǎn)色素的放線菌，探索了寒地黑土的微生物菌種及其代謝產(chǎn)物，獲取了一種有應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物，根據(jù)培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行了放線菌菌株的鑒定，并對(duì)色素的性質(zhì)做出探究，為此放線菌色素的使用條件提供了參考，為天然色素的開(kāi)發(fā)應(yīng)用拓寬了領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土樣來(lái)源

黑龍江省牡丹江市(東經(jīng)128°02′～131°18′、北緯43°24′～45°59′)。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，硫酸鎂0.8 g，硫酸亞鐵0.05 g。

高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，硫酸鎂0.8 g，硫酸亞鐵0.05 g，瓊脂粉20.0 g。

燕麥汁瓊脂(ISP3)固體培養(yǎng)基：燕麥片20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，瓊脂粉20.0 g。

指示菌培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂5 g。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BS-224-S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器、KQ-250DE臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SHB-IV分光光度儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 菌種篩選

將土樣晾干后取5 g，將其研磨后加入無(wú)菌水制成懸液，放入搖床于28 ℃、180 r/min振蕩1 h后將懸液過(guò)濾后得到原液，將原液依次稀釋至10-5，選取濃度為10-3、10-4和10-5的稀釋液涂布在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上并在28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

15 d后將平板中的放線菌挑出并將其接種到燕麥培養(yǎng)基上，若沒(méi)有單一菌落可再次傳代，直到得到單一菌落，命名為GS-1。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察和染色

將菌株GS-1接種于ISP3固體培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d后，觀察菌落大小、顏色、邊緣狀況。

將菌株GS-1接種于GY液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)3～4 d，取菌液置于載玻片上，固定后用番紅染色，觀察菌絲形態(tài)。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

液體培養(yǎng)：用接種鏟從長(zhǎng)滿(mǎn)孢子的斜面培養(yǎng)基上刮取GS-1菌落，并將其接種在GY液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)3～4 d。

分子生物學(xué)鑒定：參考李小霞等[14]采用的DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳實(shí)驗(yàn)方法。

建樹(shù)：通過(guò)MEGA 6.06軟件中的鄰近連接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最后通過(guò)比較獲得的序列，通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[15]。

1.4 色素提取

1.4.1 SDS提取法

稱(chēng)取2 g的SDS溶于100 mL水中配制成2%的SDS，調(diào)節(jié)pH至12待用；取10 mL發(fā)酵液，加入濃度為2%的SDS(pH 12)，50 ℃下攪拌25 min后以5000 r/min離心20 min。重復(fù)上述操作，直至沉淀發(fā)白，吸取上清液測(cè)定波長(zhǎng)259 nm下的OD值。

1.4.2 堿提取法

取10 mL發(fā)酵液，將pH調(diào)至9，以5000 r/min離心20 min，取上清，于波長(zhǎng)259 nm下測(cè)OD值。

1.4.3 超聲提取法

取10 mL發(fā)酵液，置于100%功率的超聲波清洗機(jī)中，在50 ℃下超聲處理20 min，以5000 r/min離心20 min，取上清，于波長(zhǎng)259 nm下測(cè)OD值。

1.4.4 藍(lán)色素的提取得率

藍(lán)色素提取產(chǎn)率定義為通過(guò)每種方法提取的色素溶液測(cè)量的OD值與通過(guò)SDS提取方法提取的色素溶液測(cè)量的OD值之間的比率。

1.5 色素性質(zhì)研究

1.5.1 藍(lán)色素紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描

取GS-1所產(chǎn)的藍(lán)色素配成溶液，在200～700 nm下掃描UV-可見(jiàn)吸收光譜。

1.5.2 溶解性實(shí)驗(yàn)

吸收相同量的樣品溶液，加入水、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中，并與10 mL各溶劑充分混合以觀察溶解情況。

1.5.3 抑菌性實(shí)驗(yàn)

使用牛津杯法測(cè)定藍(lán)色素對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(白葡萄球菌)的抑制作用。

1.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.5.4.1 pH對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

各取10 mL稀釋的原液，分裝在5個(gè)100 mL Erlenmeyer燒瓶中，將稀釋原液的pH值分別調(diào)至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，將在室溫下避光儲(chǔ)存的稀釋儲(chǔ)備溶液用作空白對(duì)照，并在259 nm下測(cè)其OD值。

1.5.4.2 直射光照射時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

取50 mL稀釋原液，置于日光下照射10 h (9∶30-19∶30)，每隔2 h取樣10 mL，將在室溫下避光儲(chǔ)存的稀釋儲(chǔ)備溶液用作空白對(duì)照，并在259 nm下測(cè)其OD值。

1.5.4.3 紫外線照射時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

取50 mL稀釋原液，置于無(wú)菌操作臺(tái)上T以紫外光照射10 h，每隔2 h取樣10 mL，將在室溫下避光儲(chǔ)存的稀釋儲(chǔ)備溶液用作空白對(duì)照，并在259 nm下測(cè)其OD值。

1.5.4.4 NaCl濃度對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

取50 mL稀釋原液，分裝在5個(gè)小試管中，每個(gè)10 mL。分別向試管中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的NaCl溶液，將在室溫下避光儲(chǔ)存的稀釋儲(chǔ)備溶液用作空白對(duì)照，并在259 nm下測(cè)其OD值。

1.5.4.5 金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

取50 mL稀釋原液，分裝向5個(gè)小試管中，每個(gè)10 mL。分別向試管中加入1 mol/L的NaCl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液、CaCl2溶液、BaCl2溶液，將在室溫下避光儲(chǔ)存的稀釋儲(chǔ)備溶液用作空白對(duì)照，并在259 nm下測(cè)其OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

在ISP3固體培養(yǎng)基上菌株GS-1的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1～圖3，番紅染色的鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 GS-1菌落形態(tài)(正)Fig.1 GS-1 colony morphology (obverse)

圖2 GS-1菌落形態(tài)(反)Fig.2 GS-1 colony morphology (reverse)

圖3 GS-1單菌落Fig.3 GS-1 single colony

圖4 GS-1鏡檢Fig.4 GS -1 microscopy

菌株GS-1的放射狀灰色菌絲向四周匍匐生長(zhǎng)，菌絲較稀疏，氣生菌絲較少，菌絲層較薄，菌落呈規(guī)則圓形，因菌絲生長(zhǎng)速度不同，邊緣不齊；孢子為灰色，由中心向四周蔓延，其密度分布呈明顯的波浪帶狀，整體孢子密度大；中間有氣生菌絲微微向上凸起，基內(nèi)菌絲呈藍(lán)色，產(chǎn)生藍(lán)色色素。

番紅染色后鏡檢可見(jiàn)菌株GS-1的菌絲呈明顯的絲狀，與基內(nèi)菌絲相比氣生菌絲更粗。

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖5。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，將質(zhì)粒送去測(cè)序，獲得GS-1的16S rRNA序列，共1589 bp，菌株GS-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.5 Results of agarose gel electrophoresis

圖6 基于16S rRNA和相關(guān)菌株的菌株GS-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of strain GS-1 based on 16S rRNA and related strains

注：分支處僅顯示出>50%的靴值，0.001代表兩個(gè)核苷的遺傳距離。

與菌株GS-1高度同源的菌株為鏈霉菌，同源性最高的菌株為Streptomycestauricus(AB045879)，同源率達(dá)99.93%。選取同源性>98%的相關(guān)菌株，通過(guò)MEGA 6.06軟件中鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖6)，并分析其進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株GS-1與Streptomycestauricus形成單一且穩(wěn)定的分支，靴值為67%，其被確定為鏈霉菌屬。

2.3 藍(lán)色素紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描

藍(lán)色素在200～700 nm處紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 藍(lán)色素紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描Fig.7 UV-visible absorption spectrum scanning of blue element

由GS-1所產(chǎn)藍(lán)色素最大吸收波長(zhǎng)為259 nm，此時(shí)的最大吸收峰為1.6519。

通過(guò)各提取方法測(cè)得的OD值與藍(lán)色素提取得率見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)色素提取得率表Table 1 Extraction rates of blue pigment

由表1可知，SDS提取法對(duì)該藍(lán)色素的提取效果最好，堿提取法其次，提取得率為60.2%，超聲提取法效果相對(duì)較差，提取得率為50.4%。

2.4 色素性質(zhì)研究

2.4.1 溶解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

相同量的色素在不同溶劑中的溶解情況見(jiàn)表2。

表2 不同溶劑中色素的溶解情況Table 2 Dissolution situation of pigment in different solvents

由表2可知，鏈霉菌GS-1所產(chǎn)藍(lán)色素易溶于水，而不易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，為水溶性色素。

2.4.2 抑菌性實(shí)驗(yàn)

藍(lán)色素對(duì)大腸桿菌和白葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表3。

表3 色素抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of pigment

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.3.1 pH對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖8。

以該色素溶液的原液作對(duì)比，當(dāng)溶液的pH為2.0～6.0時(shí)，色素相對(duì)穩(wěn)定，在樣品的pH超過(guò)8.0時(shí)，樣品的OD值顯著升高。在不同的pH條件下色素有不同的顏色，當(dāng)樣品溶液的pH為酸性時(shí)，溶液顏色為粉紅色；當(dāng)樣品溶液的pH為堿性時(shí)，溶液顏色為藍(lán)色，且pH越高藍(lán)色越深，與李一葦?shù)鹊膶?shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[16]。

2.4.3.2 光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

直接光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖9。

圖9 直射光光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of direct light duration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對(duì)比，隨著直射光光照時(shí)間的增長(zhǎng)，樣品的OD值顯著降低。直射光光照時(shí)間在2～6 h(9∶30-15∶30)內(nèi)，樣品的OD值隨著時(shí)間增長(zhǎng)而變??；在第8 h(15∶30-17∶30)時(shí)，色素的OD值上升；在第8～10 h(17∶30-19∶30)時(shí)，樣品的OD值下降。 此結(jié)果與吳恒[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差距較大，可能是因?yàn)樵O(shè)置測(cè)定的時(shí)間間隔不同。

2.4.3.3 紫外光光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

紫外光光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖10。

圖10 紫外光光照時(shí)間對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of ultraviolet light duration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對(duì)比，色素在紫外光下光照時(shí)間越長(zhǎng)，穩(wěn)定性越差，與吳恒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。該色素儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)小心儲(chǔ)藏，以避免暴露在紫外線下。

2.4.3.4 NaCl濃度對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

NaCl濃度對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖11。

圖11 NaCl濃度對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of NaCl concentration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對(duì)比，該樣品在有Na+存在的情況下穩(wěn)定性較差，NaCl濃度為0.4 mol/L時(shí)，色素的OD值最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Na+有一定的增色作用。

2.4.3.5 金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖12。

圖12 金屬離子對(duì)藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of metal ions on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對(duì)比，樣品在5種金屬離子影響下OD值均有所升高，Ba2+對(duì)色素溶液的OD值有很大影響，而其他4種離子對(duì)樣品溶液的影響較小，與韋瑤等的研究結(jié)果基本一致[18]。加入Ba2+后，由于絡(luò)合物的形成，色素溶液較渾濁，因此在使用此色素時(shí)，應(yīng)盡可能避免其與Ba2+接觸。

3 結(jié)論與討論

天然色素在食品方面不僅可以作為增色劑，還可以作為食品的包裝材料，具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。我國(guó)目前食品中允許使用的藍(lán)色素只有兩種，即梔子藍(lán)色素和藻藍(lán)色素，因此，藍(lán)色素的開(kāi)發(fā)和使用就顯得尤為重要。Zhu Yunping等從鏈霉菌A1013Y中分離到一種新型藍(lán)色素，純化后組分為4,8,13-三羥基-6,11-二氫-三氫花青素A(TDTA)，此種色素可有效清除人體自由基[19]。邊名鴻等[20]從類(lèi)芽孢桿菌XF-105中提取了紅色素并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)該紅色素溶于乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等，微溶于水，不溶于正丁醇；pH、溫度、氧化劑、還原劑及常用食品添加劑等對(duì)該色素的穩(wěn)定性影響較小，光照對(duì)色素穩(wěn)定性影響顯著；Mg2+、K+、Na+對(duì)紅色素穩(wěn)定性基本沒(méi)有影響，Mn2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+等金屬離子對(duì)紅色素都有不同程度的消色作用。

天然的藍(lán)色素具有很強(qiáng)的抑菌作用，在食品保藏方面具有很大前景。根據(jù)寒地黑土的特殊生態(tài)環(huán)境，分離篩選出一株產(chǎn)藍(lán)色素的放線菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特征及分子生物學(xué)鑒定并通過(guò)構(gòu)建發(fā)育樹(shù)將該菌株GS-1確定為鏈霉菌屬，并制備了微生物的代謝產(chǎn)物。本研究所獲得的藍(lán)色素在酸性條件下為粉紅色，在堿性條件下藍(lán)色素顏色加深；當(dāng)溶液中存在NaCl時(shí)，它是穩(wěn)定的，當(dāng)NaCl的濃度為0.4 mol/L時(shí)，對(duì)色素有明顯的增色作用；當(dāng)Na+、K+、Ca2+、Mg2+存在時(shí)，對(duì)色素影響較小，若Ba2+存在，則色素溶液變渾濁。該色素對(duì)大腸桿菌和白葡萄球菌均有抑制作用，避光穩(wěn)定性較強(qiáng)，該菌株具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。