楊宇霞，韓建欣，李婷，李慧，趙欣，郭向榮

(1.山西省生物研究院有限公司，太原 030006；2.山西省煤炭中心醫(yī)院，太原 030006)

山西老陳醋是我國四大名醋之一，其傳統(tǒng)釀造工藝始創(chuàng)于明代(1368年)，迄今已經(jīng)有600多年的歷史。其采用獨(dú)特的“蒸、酵、熏、淋、曬”生產(chǎn)工藝，具有綿、酸、香、甜、鮮的風(fēng)味特點(diǎn)——色澤深褐，醋香濃郁，酯香醇厚，過夏不腐，入冬不凍，素有“天下第一醋”的美譽(yù)[1-3]。山西老陳醋富含多種有效成分[4-6]，包括酯、醇、酮、醛等呈香物質(zhì)和氨基酸、有機(jī)酸、糖類、無機(jī)物等呈味物質(zhì)[7,8]，不僅是人們生活中的調(diào)味佳品，而且具有軟化血管、祛濕防病、美容健體等功效[9]。乙偶姻(acetoin，ACT)，學(xué)名3-羥基丁酮，在醋的釀制過程中由α-乙酰乳酸脫羧酶轉(zhuǎn)化雙乙酰產(chǎn)生[10,11]，是食醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)[12,13]。川芎嗪，學(xué)名四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用，是山西老陳醋中又一重要的活性成分[14]，并且在2013版山西老陳醋地理標(biāo)志產(chǎn)品國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加了川芎嗪作為功能性指標(biāo)[15]。因此，研究乙偶姻和川芎嗪在山西老陳醋生產(chǎn)過程中的生成及變化趨勢(shì)，對(duì)改善山西老陳醋風(fēng)味、提升山西老陳醋品質(zhì)具有重要意義。

本研究對(duì)山西老陳醋酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏醅階段樣品中乙偶姻和川芎嗪含量進(jìn)行了測(cè)定，并分析了各釀造階段乙偶姻和川芎嗪的變化趨勢(shì)，為探尋山西老陳醋活性成分發(fā)酵工藝和川芎嗪形成機(jī)理等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

采集山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝3條生產(chǎn)線不同階段的樣品，分別為酒精發(fā)酵第1天(J1)、第2天(J2)、第3天(J3)、第18天(J18)；醋酸發(fā)酵第1～9 天(C1～C9)；熏醅階段第1～6 天(X1～X6)，共計(jì)19個(gè)。

1.1.2 主要試劑

鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品、乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Agilent TC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；TG16-WS高速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；KQ-500D超聲波清洗儀 東莞市科橋超聲波儀器有限公司；NW150V超純水系統(tǒng) 上海康雷分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

酒醅：取當(dāng)日酒醅樣品，用濾紙過濾，濾液備用。

醋醅：取當(dāng)日醋醅樣品，稱取10.00 g樣品，加入90 mL新煮沸冷卻的蒸餾水浸泡1 h，然后用濾紙過濾，濾液備用。

熏醅：取當(dāng)日熏醅樣品，之后的操作同醋醅樣品。

1.3.2 提取

吸取4 mL濾液于25 mL比色管中，調(diào)節(jié)pH值約為7.2，加入1%醋酸水溶液(0.05%三氟乙酸)/甲醇為20∶80至刻度。混勻后，超聲提取45 min，離心5 min(10000 r/min)，棄去沉淀。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相：1%醋酸水溶液(加0.05%三氟乙酸)/甲醇為70∶30；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長：279 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取乙偶姻2.5 g、川芎嗪25 mg，用流動(dòng)相溶解并分別定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為乙偶姻50 mg/mL、川芎嗪500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02，0.05，0.10，0.20，0.40，1.00 mL，川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.04，0.10，0.20，0.40，0.80，2.00 mL，用流動(dòng)相定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為乙偶姻0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，5.00 mg/mL，川芎嗪2.00，5.00，10.00，20.00，40.00，100.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。乙偶姻質(zhì)量濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，川芎嗪質(zhì)量濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ACT

圖2 川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of TMP

結(jié)果表明，乙偶姻質(zhì)量濃度在0.10～5.00 mg/mL、川芎嗪質(zhì)量濃度在2.00～100.00 μg/mL時(shí)，與色譜峰響應(yīng)面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 山西老陳醋不同生產(chǎn)階段乙偶姻和川芎嗪含量的變化

2.2.1 酒精發(fā)酵階段乙偶姻和川芎嗪含量的變化

采集山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝酒精發(fā)酵階段樣品，測(cè)定其乙偶姻和川芎嗪的含量。結(jié)果顯示：未發(fā)現(xiàn)乙偶姻和川芎嗪。

2.2.2 醋酸發(fā)酵階段乙偶姻和川芎嗪含量的變化

采集山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝醋酸發(fā)酵階段樣品，測(cè)定其乙偶姻和川芎嗪的含量。結(jié)果顯示：醋酸發(fā)酵階段未發(fā)現(xiàn)川芎嗪，乙偶姻含量變化見圖3。

由圖3可知，山西老陳醋中乙偶姻最早產(chǎn)生于醋酸發(fā)酵階段第2天，隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，其含量呈逐漸上升趨勢(shì)，并且在醋酸發(fā)酵進(jìn)行到第8～9 天時(shí)，乙偶姻含量基本達(dá)到穩(wěn)定。對(duì)比生產(chǎn)線1，2，3樣品中乙偶姻含量可以看出，不同生產(chǎn)批次樣品中乙偶姻含量不盡相同，可能與生產(chǎn)時(shí)間不同、所用大曲及原料批次不同、環(huán)境條件差異等有關(guān)。

圖3 山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段乙偶姻含量變化Fig.3 The change of ACT content in Shanxi aged vinegar during acetic acid fermentation stage

2.2.3 熏醅階段乙偶姻和川芎嗪含量的變化

采集山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝熏醅階段樣品，測(cè)定其乙偶姻和川芎嗪的含量。熏醅階段樣品中乙偶姻含量見圖4，川芎嗪含量見圖5，生產(chǎn)線1樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化見圖6，生產(chǎn)線2樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化見圖7，生產(chǎn)線3樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化見圖8。

圖4 山西老陳醋熏醅階段乙偶姻含量變化Fig.4 The change of ACT content of in Shanxi aged vinegar during fumigation stage

圖5 山西老陳醋熏醅階段川芎嗪含量變化Fig.5 The change of TMP content in Shanxi aged vinegar during fumigation stage

圖6 熏醅階段生產(chǎn)線1樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化Fig.6 The change of ACT and TMP content in samples of production line 1 during fumigation stage

圖7 熏醅階段生產(chǎn)線2樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化Fig.7 The change of ACT and TMP content in samples of production line 2 during fumigation stage

圖8 熏醅階段生產(chǎn)線3樣品中乙偶姻和川芎嗪含量變化Fig.8 The change of ACT and TMP content in samples of production line 3 during fumigation stage

由圖6～圖8可知，山西老陳醋中川芎嗪最早產(chǎn)生于熏醅階段第2天，并隨著熏醅階段的進(jìn)行，川芎嗪含量大幅上升，從未檢出到最高質(zhì)量濃度82.16 μg/mL，說明熏醅階段的條件極有利于川芎嗪的生成。乙偶姻含量在熏醅階段呈整體下降的趨勢(shì)。對(duì)比圖6～圖8可知，不同生產(chǎn)批次熏醅階段樣品中乙偶姻和川芎嗪含量存在差異，而且乙偶姻含量較高的樣品中川芎嗪含量并不一定高，但是熏醅階段樣品中乙偶姻下降、川芎嗪上升趨勢(shì)均一致。

3 結(jié)論

乙偶姻和川芎嗪都是山西老陳醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏醅階段的山西老陳醋樣品中乙偶姻和川芎嗪含量進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，乙偶姻最早產(chǎn)生于醋酸發(fā)酵階段第2天，其含量在醋酸發(fā)酵和熏醅階段呈先上升后下降的趨勢(shì)；川芎嗪最早產(chǎn)生于熏醅階段第2天，并在此階段大量生成得以富集，可見山西老陳醋熏醅工藝條件非常有利于川芎嗪的生成，川芎嗪是山西老陳醋重要的特征指標(biāo)之一。在保持山西老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝的前提下，進(jìn)一步優(yōu)化醋酸發(fā)酵、熏醅階段的各種條件，是提高乙偶姻和川芎嗪含量、提升山西老陳醋品質(zhì)的重要途徑。

隨著熏醅階段的進(jìn)行，乙偶姻含量逐漸減少而川芎嗪含量逐漸增多，說明山西老陳醋中川芎嗪可能是由乙偶姻與氨氣作用后轉(zhuǎn)化而來；而不同生產(chǎn)批次樣品中川芎嗪含量并不隨著乙偶姻含量的增加而增加，推測(cè)川芎嗪的生成還有其他途徑，乙偶姻與氨氣反應(yīng)是川芎嗪生成的一種途徑，但不是唯一途徑。此研究結(jié)果為進(jìn)一步探尋山西老陳醋中川芎嗪的生成機(jī)理提供了參考。