楊昭，姚玉靜，黃佳佳，梁瑞進，梁健平，何惠

(廣東食品藥品職業(yè)學院 食品學院，廣州 510520)

牡蠣富含蛋白質，營養(yǎng)價值高，被稱為“海洋牛奶”，是世界第一大養(yǎng)殖貝類[1]。采用蛋白酶對牡蠣進行酶解，是制備牡蠣呈味基料的重要方法[2]。由于牡蠣酶解液中富含功能肽和游離氨基酸，被認為是極具應用前景的高品質呈味基料[3]。呈味基料具有強烈的鮮味和特征性風味，對高值調味品和調味醬的研制有重要作用[4]，呈味基料的風味對其應用有重要影響?，F(xiàn)有大量研究者關注牡蠣酶解前后揮發(fā)性風味物質的變化。劉曉麗等[5]采用SPME-GC-MS從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蠣的酶解液中分別鑒定出62種和60種成分，主要有烴類、醇類、醛類、酮類和含硫化合物等。鄧嫣容[6]采用氣相色譜-質譜法對復合蛋白酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶)酶解牡蠣的酶解液風味成分進行分析，鑒定出20種化合物。張梅超[7]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解后腥味、苦澀味和哈喇味加重，青草味減少。蘇明月等[8]采用SPME-GC-MS對堿性蛋白酶酶解牡蠣過程中的揮發(fā)性風味成分進行分析，在0，1，3 h從牡蠣酶解液中分別鑒定出31，32，36種揮發(fā)性風味物質。前期研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶和風味蛋白酶組成的復合酶是制備牡蠣呈味基料較佳的蛋白酶組合。但隨著酶解時間的增加，牡蠣酶解液的感官評分卻呈現(xiàn)先緩慢升高再緩慢降低的趨勢[9]。牡蠣酶解過程中脂質氧化降解和蛋白質降解，會對牡蠣酶解液的風味造成影響[10]。因此，為探究復合蛋白酶酶解時間對牡蠣酶解液揮發(fā)性風味物質的影響，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜(SPME-GC-MS)聯(lián)用法分析0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液的揮發(fā)性成分，為牡蠣呈味基料的工業(yè)化應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣肉：購于廣州黃沙水產市場；胰蛋白酶：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；風味蛋白酶：諾維信(中國)生物技術有限公司；氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津制作所；FE22-Standard pH計 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學儀器有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；50 μm二乙苯基/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭、手動SPME進樣手柄 美國Supelco 公司。

1.3 牡蠣酶解液制備

凍藏牡蠣肉置于室溫溶解后，準確稱取100 g，加入100 g蒸餾水，打漿后調整pH值至7.0，加入漿液總重量0.2%的胰蛋白酶和0.1%的風味蛋白酶，攪拌均勻后倒入1 L的燒杯中，在55 ℃水浴搖床中分別酶解0.5，1，4，8 h。酶解結束后，將盛有酶解液的燒杯置于水浴鍋中于95 ℃滅酶20 min。酶解液室溫冷卻后，在4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取上清液即為牡蠣酶解液，-18 ℃凍存?zhèn)溆肹11]。

1.4 揮發(fā)性風味成分分析

1.4.1 揮發(fā)性風味成分提取

稱取3 g牡蠣酶解液，裝入頂空萃取瓶中，置于55 ℃下平衡10 min后，將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中，吸附1 h后拔出萃取頭，用于GC-MS檢測。

1.4.2 揮發(fā)性風味成分鑒定

色譜條件：Rts-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。不分流進樣，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為0.8 mL/min。升溫程序：柱初溫35 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至100 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度為230 ℃，解吸溫度為230 ℃，解吸時間為5 min。

質譜條件：離子化方式EI；電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍35～500 m/z。

1.4.3 揮發(fā)性風味成分圖譜分析

通過NIST 11譜庫對各色譜峰進行檢索，取相似度大于80%的物質，并結合文獻報道對物質進行定性，確定揮發(fā)性風味成分。僅統(tǒng)計相對含量≥0.1%的化合物，以面積歸一化法確定各揮發(fā)性風味成分的相對含量[12]。

2 結果與分析

2.1 SPME-GC-MS總離子流色譜圖

酶解時間為0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味成分總離子流色譜圖見圖1～圖4。

圖1 0.5 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 0.5 h

圖2 1 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 1 h

圖3 4 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 4 h

圖4 8 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 8 h

由圖1～圖4可知，4種牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分的總離子流色譜圖分離度較好，揮發(fā)性成分出峰時間主要在10～20 min和30～40 min之間。牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分通過SPME萃取，經GC-MS分析，保留匹配度≥80的化合物，在4種牡蠣酶解液中共鑒定出89種化合物。0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液分別鑒定出51，52，60，51種化合物。

2.2 不同酶解時間牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分比較

表1 牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分種類和相對含量Table 1 The types and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

注“—”表示未檢測出。

表2 牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分中各類化合物的數(shù)量和相對含量Table 2 The quantity and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

由表1和表2可知，0.5 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有10種醇類(20.59%)、15種醛類(22.89%)、6種酯類(5.41%)、4種酮類(1.33%)、11種烴類(16.61%)和5種雜環(huán)和其他類(1.54%)。1 h牡蠣酶解液鑒定出52種化合物，主要含有9種醇類(15.91%)、16種醛類(16.13%)、6種酯類(5.57%)、4種酮類(0.77%)、9種烴類(16.04%)和8種雜環(huán)和其他類(2.22%)。4 h牡蠣酶解液鑒定出60種化合物，主要含有10種醇類(23.08%)、16種醛類(9.99%)、5種酯類(5.71%)、5種酮類(1.69%)、15種烴類(22.58%)和9種雜環(huán)和其他類(2.51%)。8 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有9種醇類(14.73%)、14種醛類(8.81%)、5種酯類(3.18%)、4種酮類(8.9%)、13種烴類(25.4%)、6種雜環(huán)和其他類(3.18%)。

4種牡蠣酶解液中均含有的揮發(fā)性風味成分有24種，包含4種醇類、10種醛類、1種酯類、4種酮類、2種烴類、3種雜環(huán)和其他類。2-壬酮、3,6-壬二烯醛、三氯乙酸壬酯、十三醛和正壬基環(huán)己烷為0.5 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風味成分。氯甲酸正壬基酯、2-溴十二烷、2-十二烯-1-醇為1 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風味成分。2-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-酮、2-甲基戊酸酸酐、環(huán)己烷-1,4-二甲醇二乙酸酯、1,1-二甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-環(huán)丙烷、2-丁基-1-辛醇、4-(1,2-二甲基環(huán)戊-2-烯基)-丁烷-2-酮、2,6,10,14-四甲基十五烷、苊、十六烯和2,4-二叔丁基苯酚為4 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風味成分。1-(2-甲氧基丙氧基)-2-丙醇、亞麻酸、庚基環(huán)己烷和亞麻醇為8 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風味成分。

醇類、醛類、酯類和酮類的風味閾值相對較低，對于風味的影響較大。為剖析酶解時間對牡蠣酶解液揮發(fā)性風味成分的影響，對4種牡蠣酶解液的揮發(fā)性風味成分進行了分析和比較。

醇類物質通常是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來。飽和醇類化合物由于閾值較大，一般對牡蠣氣味貢獻不大。但有些含量特別高或是不飽和的烯醇式結構化合物閾值較低，可能會對牡蠣風味有較大貢獻。醇類物質通常具有植物香甜味、柔和的芳香、酸敗和土氣味。1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇是亞油酸酯或亞麻酸酯氫過氧化合物的降解產物，在海南島養(yǎng)殖近江牡蠣中被鑒定出，被認為是牡蠣特有的類似蘑菇香氣的主要成分[13]。由表1可知，1-辛烯-3-醇在4種牡蠣酶解液中均存在，且是醇類物質中含量最高的，其在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為7.74%、7.23%、10.04%和9.86%。2-辛烯-1-醇在0.5，1，4 h牡蠣酶解液中含量分別為2.1%、1.63%和2.01%，而其在8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。

醛類物質是脂肪氧化的主要產物，閾值相對較低，對水產品的風味有較大的貢獻[14]。目前已確認水產品的魚腥味物質為一些醛類和烯醛類，主要包括以下幾種化合物：正己醛、正庚醛、2,4-二烯癸醛、2,4,7-三烯癸醛、二烯庚醛、二烯癸醛和4-烯庚醛等[15]。4-庚烯醛具有魚腥味、青草、油脂香氣。2-辛烯醛具有油脂味、堅果味。2,6-壬二烯醛具有黃瓜味。3,6-壬二烯醛具有青味。2-壬烯醛具有肉香、蘑菇、青味。癸醛具有海味。辛醛具有脂味、蘑菇味。由表1可知，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛在4種牡蠣酶解液中均存在，且是醛類物質中含量最高的。4-庚烯醛在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為4.59%、3.87%、2.38%和2.04%。2,6-壬二烯醛在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為12.22%、7.08%、1.76%和0.22%。隨著酶解時間的增加，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛相對含量明顯減少。

酯類化合物是醇和酸通過酯化作用縮合而成，閾值較低，一般具有顯著的香味特征[16]。4種牡蠣酶解液的酯類揮發(fā)性成分種類存在較大的差異。3-己烯醇甲酸酯和酞酸二乙酯在牡蠣酶解液中含量較高。 3-己烯醇甲酸酯在0.5 h和1 h牡蠣酶解液中含量分別為1.63%和1.54%，而其在4 h和8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。酞酸二乙酯在0.5，1，4 h牡蠣酶解液中含量分別為2.89%、3.25%和3.63%，而其在8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。

酮類化合物可能是氨基酸分解、多不飽和脂肪熱氧化和降解或微生物氧化產生，其閾值一般比較高。酮類貢獻出牡蠣甜的花香、果香等氣味。4種牡蠣酶解液的酮類揮發(fā)性成分種類有較大的差異，且含量均較低。苯乙酮在4種牡蠣酶解液中均存在，但在8 h牡蠣酶解液中含量最高，為6.55%。2-甲基環(huán)辛烷-1-酮在8 h牡蠣酶解液中含量也較高，相對含量為1.67%。

3 結論

4種牡蠣酶解液中共鑒定出89種化合物。0.5 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有10種醇類(20.59%)、15種醛類(22.89%)、6種酯類(5.41%)、4種酮類(1.33%)、11種烴類(16.61%)和5種雜環(huán)和其他類(1.54%)。1 h牡蠣酶解液鑒定出52種化合物，主要含有9種醇類(15.91%)、16種醛類(16.13%)、6種酯類(5.57%)、4種酮類(0.77%)、9種烴類(16.04%)和8種雜環(huán)和其他類(2.22%)。4 h牡蠣酶解液鑒定出60種化合物，主要含有10種醇類(23.08%)、16種醛類(9.99%)、5種酯類(5.71%)、5種酮類(1.69%)、15種烴類(22.58%)和9種雜環(huán)和其他類(2.51%)。8 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有9種醇類(14.73%)、14種醛類(8.81%)、5種酯類(3.18%)、4種酮類(8.9%)、13種烴類(25.4%)、6種雜環(huán)和其他類(3.18%)。4種牡蠣酶解液中均含有的揮發(fā)性風味成分有24種，包含4種醇類、10種醛類、1種酯類、4種酮類、2種烴類、3種雜環(huán)和其他類化合物。