楊林子，盧云浩，何強(qiáng)

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

郫縣豆瓣是以優(yōu)質(zhì)的辣椒和蠶豆為主要原料，經(jīng)多種微生物發(fā)酵而成的半固態(tài)調(diào)味品，具有味辣香醇、紅棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠絨實(shí)、醬香濃郁的特點(diǎn)，堪稱“川菜之魂”[1]。郫縣豆瓣的生產(chǎn)包括辣椒發(fā)酵、制曲-蠶豆發(fā)酵和混合后熟發(fā)酵3個(gè)階段，其釀制采用開放式的發(fā)酵體系[2]，利用發(fā)酵環(huán)境中的各類微生物進(jìn)行物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)換和信息傳遞，從而形成郫縣豆瓣獨(dú)特的品質(zhì)特征。但由于其微生物區(qū)系復(fù)雜，造成了目前發(fā)酵過程難于控制、產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等問題[3]。因此，為實(shí)現(xiàn)郫縣豆瓣的定向控制發(fā)酵，提高生產(chǎn)效率，確保產(chǎn)品質(zhì)量與安全，需對(duì)郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的微生物群落演替規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)深入的認(rèn)識(shí)。

近年來，高通量測序技術(shù)因產(chǎn)量大、錯(cuò)誤率低、性價(jià)比高、靈活性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物多樣性的研究，如意式Salami、韓式Doenjang、日式Miso等[4-6]，但該技術(shù)可以將樣品中葉綠素及死菌DNA測定在內(nèi)，導(dǎo)致微生物多樣性結(jié)果往往高于樣品實(shí)際情況。因此，多方法聯(lián)用分析能更真實(shí)地反映食品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，本研究同時(shí)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法和Illumina MiSeq測序技術(shù)分析郫縣豆瓣3個(gè)發(fā)酵階段的微生物群落演替情況，以揭示郫縣豆瓣發(fā)酵過程中微生物的動(dòng)態(tài)變化，為更好地認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵機(jī)制、優(yōu)化發(fā)酵工藝、控制食品質(zhì)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取自郫縣某豆瓣生產(chǎn)工廠，具體生產(chǎn)工藝見本團(tuán)隊(duì)研究成果[7]。本實(shí)驗(yàn)選取5個(gè)樣品點(diǎn)：辣椒發(fā)酵末期、蠶豆發(fā)酵中期、蠶豆發(fā)酵末期、混合發(fā)酵中期、混合發(fā)酵末期(分別編號(hào)為1，2，3，4，5)。取樣時(shí)從每個(gè)發(fā)酵池的上層(距表面0～20 cm)、中層(距表面30～50 cm)、下層(距池底0～20 cm)各取25.0 g左右，將其混合均勻，低溫密封運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：北京藍(lán)橋生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒、Tris HCl、dNTP、引物：上海生工生物科技有限公司；E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒：美國Omega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；其他化學(xué)試劑：均為分析純，成都科龍化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

P-330納米光度計(jì) Implen公司；Illumina MiSeq測序儀 Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)鑒定法

1.3.1.1 樣品微生物計(jì)數(shù)、分離與純化

將郫縣豆瓣樣品研磨均勻，準(zhǔn)確稱取25.0 g樣品加至225 mL無菌生理鹽水中充分混合后，進(jìn)行梯度稀釋(10-1～10-6)并涂布在YPD、NB及GAM培養(yǎng)基平板上，分別在28，37，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)后進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，挑取形態(tài)各異的單一菌落進(jìn)行分離純化，采用相應(yīng)液體培養(yǎng)基擴(kuò)培后置于-80 ℃甘油中保藏備用，無菌水代替菌液作為空白組。

1.3.1.2 DNA提取與鑒定

微生物DNA依據(jù)細(xì)菌、真菌提取試劑盒說明書提取。

細(xì)菌PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)10 μmol/L各2 μL，20 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃保持10 min。

真菌PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) 10 μmol/L各1 μL，22 μL ddH2O。反應(yīng)條件同細(xì)菌。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托成都生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2 高通量測序技術(shù)

1.3.2.1 DNA的提取

依據(jù)E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒提取樣品中的DNA。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增及MiSeq測序

PCR擴(kuò)增，分別用338F(5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′)和ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTAA-3′)/2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCG-ATGC-3′)通用引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS進(jìn)行MiSeq測序，采用FastPfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，每組樣品設(shè)置3個(gè)平行，并利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris HCl洗脫后進(jìn)行熒光定量。根據(jù)TruSeqTM DNA試劑盒的說明書對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Flash軟件對(duì)1.3.2.2中所得序列進(jìn)行拼接、過濾和優(yōu)化，采用QIIME Pipeline去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，得到高質(zhì)量序列進(jìn)一步分析。以97%的相似性對(duì)操作分類單元(OTUs)進(jìn)行分類，微生物α多樣性利用香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和Bayesian算法表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣不同發(fā)酵階段菌落總數(shù)

真菌、好氧細(xì)菌(含兼性厭氧細(xì)菌，下同)和厭氧細(xì)菌(含兼性厭氧細(xì)菌，下同)在郫縣豆瓣各發(fā)酵階段表現(xiàn)出了不同的變化，見表1。

表1 郫縣豆瓣不同發(fā)酵階段菌落總數(shù)Table 1 Total bacterial colony number of Pixian broad bean paste at different fermentation stages CFU/g

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

辣椒發(fā)酵階段，生物量約為0.08×104～4.6×104CFU/g，均在較低水平，可能是由于發(fā)酵的高鹽環(huán)境所致。蠶豆發(fā)酵階段，由于米曲霉的接種，初期真菌總數(shù)達(dá)1.05×109CFU/g(數(shù)據(jù)未顯示)，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，真菌總數(shù)不斷下降，甜瓣子中真菌生物量降至1.1×104CFU/g；而好氧細(xì)菌的生物量大致維持在1.0×106CFU/g左右，高于厭氧細(xì)菌含量?；旌习l(fā)酵階段，真菌總數(shù)不斷增加，末期含量約為1.1×105CFU/g；好氧細(xì)菌一直維持在1.4×105CFU/g；厭氧細(xì)菌為該階段的劣勢(shì)菌，這可能是由于該階段的定期翻缸，使得基質(zhì)氧氣均勻充足，不利于厭氧細(xì)菌的生長[8]?？傮w來看，在整個(gè)發(fā)酵過程中，蠶豆發(fā)酵階段的菌落總數(shù)最高，好氧細(xì)菌和真菌為主要優(yōu)勢(shì)菌落。

2.2 培養(yǎng)鑒定法分析微生物群落結(jié)構(gòu)

通過培養(yǎng)法共鑒定到12個(gè)屬，27個(gè)種的微生物，見表2。

表2 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法分析郫縣豆瓣微生物多樣性Table 2 Analysis of microbial diversity of Pixian broad bean paste based on traditional culture identification method

續(xù) 表

細(xì)菌的多樣性及組成見圖1。

圖1 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法分析郫縣豆瓣不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

由圖1中A可知，好氧細(xì)菌中，整個(gè)發(fā)酵過程總體以Bacillussp.和Gracilibacillussp.為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。辣椒發(fā)酵階段微生物多樣性最為豐富，以Bacillusamyloliquefaciens和Gracilibacillustimonensis為主，兩者占比達(dá)56.02%；蠶豆發(fā)酵階段與混合發(fā)酵階段菌落組成相似，均以Bacillusamyloliquefaciens，Bacillussubtilis，Bacillusmethylotrophicus為優(yōu)勢(shì)菌，但組成比例有一定差異，B.amyloliquefaciens含量在兩個(gè)發(fā)酵階段整體均呈上升趨勢(shì)，最終占比分別為63.96%和72.93%；B.subtilis含量在蠶豆發(fā)酵后期有所減少，混合發(fā)酵階段基本維持穩(wěn)定，它是豆瓣中主要的腐敗菌，但可以很好地抑制黃曲霉毒素的生長[9]。

由圖1中B可知，厭氧細(xì)菌中，辣椒及蠶豆發(fā)酵階段均以Tetragenococcushalophilus為優(yōu)勢(shì)菌，分別占比51.25%和71.19%，混合發(fā)酵階段，Bacilluslicheniformis，Oceanobacillustimonensis兩者占比達(dá)到95%以上，而T.halophilus幾乎檢測不到，這可能是由于T.halophilus有更好厭氧環(huán)境，而混合發(fā)酵階段的定期攪拌使得發(fā)酵環(huán)境中氧含量充足。

對(duì)真菌而言，辣椒發(fā)酵階段以Candidaetchellsii，Zygosaccharomycesrouxii為優(yōu)勢(shì)菌，兩者占比分別為57.14%和32.65%，見圖2。

圖2 基于傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法分析郫縣豆瓣不同發(fā)酵階段的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

蠶豆發(fā)酵階段，由于微氧及高鹽環(huán)境，初期接種的Aspergillusoryzae隨著發(fā)酵的進(jìn)行占比不斷減少，到末期僅占0.88%，這與蠶豆發(fā)酵階段的真菌總數(shù)測定結(jié)果一致(見表1)；Candidaversatilis占比達(dá)到70%以上，Z.rouxii次之，約占20%。由于辣椒胚和甜瓣子的混合，混合發(fā)酵中期展現(xiàn)出最為豐富的真菌多樣性，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，部分微生物逐漸消亡，后期菌群由C.versatilis，Z.rouxii和C.etchellsii共同組成，三者占比分別為72.82%、13.59%、13.59%。

2.3 微生物多樣性分析

微生物群落的多樣性、豐富度及測序深度分別采用Shannon指數(shù)、Chao 1及Coverage來評(píng)估。

表3 基于97%相似水平的微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 Microbial community diversity indexes based on 97% similarity level

續(xù) 表

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

由表3可知，各樣本的Coverage均大于99.9%，表明目前的測序深度較為合理，可以很好地反映樣本中微生物的多樣性變化情況。整體而言，蠶豆發(fā)酵階段的細(xì)菌多樣性最高，細(xì)菌豐富度最低；真菌多樣性和豐富度在蠶豆發(fā)酵階段均最低，這可能與米曲霉的接種有關(guān)。

2.4 Illumina MiSeq測序分析微生物群落結(jié)構(gòu)

圖3 Illumina MiSeq測序分析細(xì)菌群落組成變化Fig.3 Analysis of the change of bacterial community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

從門水平來看，細(xì)菌群落共歸屬于5個(gè)門。由圖3中A可知，相對(duì)豐度在1%以上的有Firmicutes，Cyanobacteria，Proteobaceria和Actinobacteria，這與Li等[10]的研究結(jié)果一致。辣椒發(fā)酵階段以Cyanobacteria為主，其相對(duì)豐度約為76.2%；蠶豆發(fā)酵階段，F(xiàn)irmicutes處于主導(dǎo)地位，Proteobaceria次之，兩者相對(duì)豐度之和大于97%；混合發(fā)酵階段，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度隨發(fā)酵進(jìn)行不斷增長，在末期其占比達(dá)94.4%。

從屬水平來看，5個(gè)樣本包括129個(gè)屬的細(xì)菌。由圖3中B可知，辣椒發(fā)酵階段以norank-c-Cyanobacteria為主，其相對(duì)豐度約76.2%。蠶豆發(fā)酵階段，細(xì)菌群落多樣性豐富，隨著發(fā)酵進(jìn)行，Bacillussp.逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌屬，甜瓣子中其相對(duì)豐度約為35.6%；另外，Citrobactersp.，Lactobacillussp.，Enterobactersp.和Lactococcussp.也同樣占據(jù)重要地位，相對(duì)豐度分別為12.03%、14.1%、7.82%、1.56%?；旌习l(fā)酵過程主要表現(xiàn)為Bacillussp.的顯著增加，末期其相對(duì)豐度達(dá)93.6%，為主要的微生物群落。

圖4 Illumina MiSeq測序分析真菌群落組成變化Fig.4 Analysis of the change of fungal community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發(fā)酵中期，3為蠶豆發(fā)酵末期(甜瓣子)，4為混合發(fā)酵中期，5為混合發(fā)酵末期(郫縣豆瓣)。

郫縣豆瓣的真菌群落歸屬于4個(gè)門，由圖4中A可知，相對(duì)豐度在1%以上的有Ascomycota，Basidiomycota，unclassified_k_Fungi。辣椒發(fā)酵階段以Ascomycota和Basidiomycota占優(yōu)勢(shì)地位，兩者相對(duì)豐度約為99.8%。蠶豆發(fā)酵階段及混合發(fā)酵階段Ascomycota相對(duì)豐度達(dá)到95%以上，在真菌群落結(jié)構(gòu)中占據(jù)主導(dǎo)地位。

從屬水平來看，樣品中真菌群落共鑒定到70個(gè)屬的微生物，其中相對(duì)豐度在1%以上的見圖4中B。辣椒發(fā)酵階段以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.和Candidasp.為優(yōu)勢(shì)菌群，占比分別為38.15%、18.83%、15.37%、13.0%、5.78%；蠶豆發(fā)酵階段，Aspergillussp.的相對(duì)豐度始終維持在99.0%以上；混合發(fā)酵階段菌落多樣性較為豐富，但仍以Aspergillussp.為優(yōu)勢(shì)菌屬，到末期相對(duì)豐度增至84.8%。

前人曾對(duì)郫縣豆瓣中的微生物進(jìn)行了大量的相關(guān)研究和報(bào)道，如張琦等[11]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)研究了郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，揭示了細(xì)菌群落變化較為明顯，且Staphylococcusxylosus和乳酸菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；汪先丁等[12]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)研究郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌群落的演替，結(jié)果顯示Aspergillusoryzae是發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)真菌。本研究采用的兩種方法均有鑒定到Bacillussp.，Gracillibacillussp.，Staphylococcussp.，Aspergillussp.，Candidasp.和Zygosaccharomycessp.，有效地證實(shí)了在郫縣豆瓣發(fā)酵過程中這些微生物的存在。然而，兩種方法鑒定結(jié)果也存在一定的差異，一些微生物如norank-c-Cyanobacteriasp.，Citrobactersp.，Alternariasp.，Wallemiasp.和Cryptococcussp.僅被Illumina MiSeq測序鑒定為優(yōu)勢(shì)菌屬，一方面是因?yàn)楝F(xiàn)階段許多微生物還不能被選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)[13]；另一方面，辣椒葉綠素DNA序列與norank-c-Cyanobacteria序列相似，可能導(dǎo)致高通量測序結(jié)果錯(cuò)誤[14]。此外，Illumina MiSeq測序結(jié)果表明Aspergillussp.在蠶豆發(fā)酵和混合發(fā)酵階段均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，但培養(yǎng)鑒定法表明其在發(fā)酵過程中快速死亡，在成品中并未被鑒定到。Lactobacillussp.，Weissellasp.，Penicilliumsp.也有類似情況，它們僅在蠶豆發(fā)酵初期被鑒定到(數(shù)據(jù)未顯示)，這可能是由于Illumina MiSeq測序可以檢測到死亡微生物群落但DNA未降解的核苷酸序列[15]。因此，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序分析可以為了解郫縣豆瓣3個(gè)發(fā)酵階段的微生物群落演替提供補(bǔ)充支持。

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)鑒定法和Illumina MiSeq測序技術(shù)結(jié)合分析郫縣豆瓣的微生物群落結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在整個(gè)發(fā)酵過程中，細(xì)菌的群落組成變化較大，其中蠶豆發(fā)酵階段的微生物菌落總數(shù)最高，混合發(fā)酵展現(xiàn)了豐富的微生物多樣性。辣椒發(fā)酵階段，真菌以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.，Candidasp.為優(yōu)勢(shì)菌屬，細(xì)菌以Gracilibacillussp.，Bacillussp.為優(yōu)勢(shì)菌屬。蠶豆發(fā)酵細(xì)菌主要包括Bacillussp.，真菌以Candidasp.，Zygosaccharomycessp.的豐度較高?；旌习l(fā)酵階段，好氧細(xì)菌和真菌占比均衡，分別以Bacillussp.,Candidasp.，Zygosaccharomycessp.為優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)合兩種分析方法全面、真實(shí)、有效地反映了郫縣豆瓣發(fā)酵過程中微生物的多樣性及菌群組成，揭示了微生物群落結(jié)構(gòu)演替過程，可為后續(xù)優(yōu)化郫縣豆瓣的發(fā)酵工藝提供理論指導(dǎo)。