楊婷,鄧楠,曠春桃
(中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,長(zhǎng)沙 410004)
香桂是樟科樟屬植物,主要產(chǎn)于我國(guó)湖南、云南、貴州等地區(qū)。鮮葉中揮發(fā)油含量高達(dá)3%~4%,莖枝、干葉、根莖和果實(shí)中揮發(fā)油含量比鮮葉中低[1]。香桂精油具有特殊香味[2],可直接用于飲料和食品工業(yè)中,如用作增香劑和防腐劑[3]。香桂精油主要成分為黃樟油素、蒎烯、芳樟醇、樟腦、丁香酚等[4],其中黃樟油素含量大于90%,是合成洋茉莉醛、新洋茉莉醛和香蘭素等香料的重要原料[5]。因此,香桂精油的提取、化學(xué)成分分析及其抗菌活性對(duì)于香桂資源的利用具有重要價(jià)值。
目前,植物精油的提取常采用水蒸氣蒸餾法(SD)、溶劑浸提法、超臨界CO2流體萃取法、微波輔助提取法(MASD)、超聲-微波輔助提取法(UMASD)等方法[6-9]。MASD是將傳統(tǒng)的溶劑萃取法與微波相結(jié)合,高頻電磁波穿透萃取介質(zhì),微波能使細(xì)胞內(nèi)部的溫度迅速上升,導(dǎo)致植物原料細(xì)胞破裂,降低了提取物溶出的傳質(zhì)阻力,提高了提取效率[10]。因此,MASD具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11],已成為植物精油提取的重要方法。
本研究以香桂葉為原料,采用MASD提取香桂精油,考察了液料比、提取時(shí)間、微波功率對(duì)香桂精油得率的影響,優(yōu)化其提取工藝,同時(shí)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)香桂精油的化學(xué)成分,并對(duì)香桂精油的抑菌活性進(jìn)行研究,旨在為香桂的綜合利用提供一定的理論支撐。
香桂葉:湖南湘西,剪碎,備用;酵母提取物、胰蛋白胨:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;青霉素鈉試劑:哈藥集團(tuán)制藥總廠;葡萄糖:天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;馬鈴薯:購(gòu)于長(zhǎng)沙市鐵道學(xué)院農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);其他試劑均為分析純。
供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger),均由本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2.1 LB培養(yǎng)基
酵母提取物5 g,氯化鈉 10 g,胰蛋白胨10 g,固體培養(yǎng)基加瓊脂15~20 g,加水定容至1 L。121 ℃滅菌30 min,待用。
1.2.2 PDA培養(yǎng)基
將200 g馬鈴薯切塊煮沸過濾得馬鈴薯汁,加葡萄糖20 g,固體培養(yǎng)基加瓊脂15~20 g,加水定容至1 L。121 ℃滅菌30 min,待用。
CW 2000超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司;HPX-9052MBE恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;CA-920-3超凈操作臺(tái) 上海凈化制備廠;Clarcus 600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Perkin Elmer公司。
1.4.1 MASD提取香桂精油
采用課題組組裝的MASD提取裝置提取香桂精油,其裝置圖見圖1。
圖1 MASD提取香桂精油的裝置圖Fig.1 Device for extracting Cinnamomum subavenium essential oil by MASD
圖1中將一定量的香桂葉和蒸餾水一起加入超聲-微波協(xié)同萃取儀中,設(shè)定提取時(shí)間和微波功率進(jìn)行香桂精油的微波提取,然后將得到的提取液靜置分層,收集精油,計(jì)算香桂精油的得率,得率按下式計(jì)算:
1.4.2 GC-MS分析
氣相色譜條件:色譜柱:Elite-5MS(30m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為He;進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫:初始溫度75 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的升溫速率升至140 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min的升溫速率升至240 ℃;進(jìn)樣量0.5 μL;分流比60∶1;稀釋比20∶1。
質(zhì)譜條件:離子源EI源;電子能量70 eV;離子源溫度240 ℃;掃描范圍35~500 m/z。
1.4.3 抑菌活性測(cè)試
細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8~10 h,真菌(根霉、黑曲霉)在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16 h。使用無菌水稀釋并制備成濃度為106~107CFU/mL的均勻菌液。采用二倍稀釋法,用滅菌處理的DMSO制備成不同濃度的香桂精油樣品溶液。
采用濾紙片法測(cè)定香桂精油的抑菌圈[12],倒入20~25 mL的LB、PDA培養(yǎng)基于無菌培養(yǎng)皿中,凝固后,分別吸取200 μL 4種菌懸液均勻涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基表面。將滅菌后直徑為5.5 mm的濾紙片貼在含菌平板上,滴加5.0 μL不同濃度的香桂精油樣品溶液,以青霉素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照,DMSO作為陰性對(duì)照。在34 ℃條件下細(xì)菌培養(yǎng)24 h,在32 ℃條件下真菌培養(yǎng)48 h。通過測(cè)量抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC),評(píng)價(jià)香桂精油的抑菌活性,每個(gè)濃度做兩組平行試驗(yàn)。
2.1.1 液料比的影響
設(shè)定微波功率為100 W,提取時(shí)間為2 h,按液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)的條件分別提取香桂精油,結(jié)果見圖2。
由圖2可知,當(dāng)液料比為20∶1(mL/g)時(shí),香桂精油得率最大,為4.30%。液料比較小時(shí),蒸餾水浸泡香桂不夠充分,香桂精油得率小,但是蒸餾水用量太大,會(huì)吸收更多的微波能,使香桂葉吸收微波能下降,導(dǎo)致微波破壞植物細(xì)胞的能力下降,香桂精油得率降低[13]。因此,20∶1(mL/g)為最佳液料比。
圖2 液料比對(duì)香桂精油得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of Cinnamomum subavenium essential oil
2.1.2 微波功率的影響
設(shè)定液料比為20∶1(mL/g),提取時(shí)間為2 h,分別在微波功率為60,70,80,90,100 W的條件下提取香桂精油,結(jié)果見圖3。
圖3 微波功率對(duì)香桂精油得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on yield of Cinnamomum subavenium essential oil
由圖3可知,當(dāng)微波功率為100 W時(shí),香桂精油得率達(dá)到最高。隨著微波功率的提高,體系的升溫速率加快,細(xì)胞壁迅速破裂,香桂精油大量進(jìn)入萃取介質(zhì)[14]。但是,微波功率太高,加熱速度過快,會(huì)使原料焦糊,有效成分可能高溫分解,香桂精油得率下降[15]。因此,100 W為微波最佳功率。
2.1.3 提取時(shí)間的影響
設(shè)定液料比為20∶1(mL/g),微波功率為100 W,分別在提取時(shí)間為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h的條件下提取香桂精油,結(jié)果見圖4。
圖4 提取時(shí)間對(duì)香桂精油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of Cinnamomum subavenium essential oil
由圖4可知,當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí),提取率達(dá)到4.43%,之后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,香桂精油得率稍有下降。這是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi),提取時(shí)間增加,物料會(huì)吸收更多的微波能,使植物細(xì)胞充分破裂,香桂精油溶出更多,所以得率上升[16]。但提取時(shí)間過長(zhǎng),有效成分揮發(fā),使香桂精油得率下降。故適宜的提取時(shí)間為1.5 h。
采用SD提取香桂葉中香桂精油,優(yōu)化其提取工藝,SD和MASD提取香桂精油的優(yōu)化工藝條件見表1。
表1 SD和MASD提取香桂精油的優(yōu)化工藝條件Table 1 Optimized process conditions of Cinnamomum subavenium essential oil extracted by SD and MASD
由表1可知,MASD提取時(shí)間為1.5 h,香桂精油得率為4.43%,比SD提高0.14%,提取時(shí)間減少,提取效率增加。
香桂精油的GC-MS分析結(jié)果見表2。
表2 香桂精油的化學(xué)成分Table 2 Chemical constituents of Cinnamomum subavenium essential oil
續(xù) 表
經(jīng)與Nist標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)照,初步分析鑒定出香桂精油中13 種成分,占色譜總流出峰面積的99.96%,相對(duì)含量最高的化合物是黃樟油素,為98.408%。還有少量的α-蒎烯、檸檬烯、沉香醇、丁子香酚、α-廣藿香等化合物。
香桂精油對(duì)4種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)見表3。
表3 香桂精油對(duì)4種菌株的最小抑菌濃度MICTable 3 MIC of Cinnamomum subavenium essential oil to four strains
注:“+”表示MIC小于 0.78 mg/mL,“-”表示無明顯抑菌圈。
結(jié)果表明,香桂精油對(duì)4種供試菌均有一定的抑菌效果,其中對(duì)根霉的抑菌活性優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉的抑菌活性。同時(shí),香桂精油對(duì)真菌的抑制作用優(yōu)于細(xì)菌。此外,香桂精油對(duì)這4種菌的抑制作用均不如青霉素鈉陽(yáng)性對(duì)照組。
本研究采用MASD從香桂葉中提取香桂精油,以香桂精油的得率為指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了其提取工藝。結(jié)果表明:在液料比為20∶1(mL/g),微波功率為100 W,提取時(shí)間為1.5 h的條件下,香桂精油得率為4.43%。與SD比較,得率提高了0.14%,并大大縮短了提取時(shí)間。采用GC-MS對(duì)香桂精油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,鑒定出 13 種成分,其中黃樟油素含量為98.408%。香桂精油對(duì)4種供試菌均具有一定的抑制作用,其中對(duì)根霉抑制作用最強(qiáng),MIC為6.25 mg/mL。