楊婷，鄧楠，曠春桃

(中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004)

香桂是樟科樟屬植物，主要產(chǎn)于我國(guó)湖南、云南、貴州等地區(qū)。鮮葉中揮發(fā)油含量高達(dá)3%～4%，莖枝、干葉、根莖和果實(shí)中揮發(fā)油含量比鮮葉中低[1]。香桂精油具有特殊香味[2]，可直接用于飲料和食品工業(yè)中，如用作增香劑和防腐劑[3]。香桂精油主要成分為黃樟油素、蒎烯、芳樟醇、樟腦、丁香酚等[4]，其中黃樟油素含量大于90%，是合成洋茉莉醛、新洋茉莉醛和香蘭素等香料的重要原料[5]。因此，香桂精油的提取、化學(xué)成分分析及其抗菌活性對(duì)于香桂資源的利用具有重要價(jià)值。

目前，植物精油的提取常采用水蒸氣蒸餾法(SD)、溶劑浸提法、超臨界CO2流體萃取法、微波輔助提取法(MASD)、超聲-微波輔助提取法(UMASD)等方法[6-9]。MASD是將傳統(tǒng)的溶劑萃取法與微波相結(jié)合，高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)，微波能使細(xì)胞內(nèi)部的溫度迅速上升，導(dǎo)致植物原料細(xì)胞破裂，降低了提取物溶出的傳質(zhì)阻力，提高了提取效率[10]。因此，MASD具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]，已成為植物精油提取的重要方法。

本研究以香桂葉為原料，采用MASD提取香桂精油，考察了液料比、提取時(shí)間、微波功率對(duì)香桂精油得率的影響，優(yōu)化其提取工藝，同時(shí)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)香桂精油的化學(xué)成分，并對(duì)香桂精油的抑菌活性進(jìn)行研究，旨在為香桂的綜合利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

香桂葉：湖南湘西，剪碎，備用；酵母提取物、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；青霉素鈉試劑：哈藥集團(tuán)制藥總廠；葡萄糖：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯：購(gòu)于長(zhǎng)沙市鐵道學(xué)院農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；其他試劑均為分析純。

供試菌種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillusniger)，均由本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基

酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，胰蛋白胨10 g，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，加水定容至1 L。121 ℃滅菌30 min，待用。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基

將200 g馬鈴薯切塊煮沸過(guò)濾得馬鈴薯汁，加葡萄糖20 g，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，加水定容至1 L。121 ℃滅菌30 min，待用。

1.3 儀器與設(shè)備

CW 2000超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司；HPX-9052MBE恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CA-920-3超凈操作臺(tái) 上海凈化制備廠；Clarcus 600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Perkin Elmer公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 MASD提取香桂精油

采用課題組組裝的MASD提取裝置提取香桂精油，其裝置圖見(jiàn)圖1。

圖1 MASD提取香桂精油的裝置圖Fig.1 Device for extracting Cinnamomum subavenium essential oil by MASD

圖1中將一定量的香桂葉和蒸餾水一起加入超聲-微波協(xié)同萃取儀中，設(shè)定提取時(shí)間和微波功率進(jìn)行香桂精油的微波提取，然后將得到的提取液靜置分層，收集精油，計(jì)算香桂精油的得率，得率按下式計(jì)算：

1.4.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱：Elite-5MS(30m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度75 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升溫速率升至140 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的升溫速率升至240 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比60∶1；稀釋比20∶1。

質(zhì)譜條件：離子源EI源；電子能量70 eV；離子源溫度240 ℃；掃描范圍35～500 m/z。

1.4.3 抑菌活性測(cè)試

細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10 h，真菌(根霉、黑曲霉)在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。使用無(wú)菌水稀釋并制備成濃度為106～107CFU/mL的均勻菌液。采用二倍稀釋法，用滅菌處理的DMSO制備成不同濃度的香桂精油樣品溶液。

采用濾紙片法測(cè)定香桂精油的抑菌圈[12]，倒入20～25 mL的LB、PDA培養(yǎng)基于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，凝固后，分別吸取200 μL 4種菌懸液均勻涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基表面。將滅菌后直徑為5.5 mm的濾紙片貼在含菌平板上，滴加5.0 μL不同濃度的香桂精油樣品溶液，以青霉素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO作為陰性對(duì)照。在34 ℃條件下細(xì)菌培養(yǎng)24 h，在32 ℃條件下真菌培養(yǎng)48 h。通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)，評(píng)價(jià)香桂精油的抑菌活性，每個(gè)濃度做兩組平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對(duì)香桂精油得率的影響

2.1.1 液料比的影響

設(shè)定微波功率為100 W，提取時(shí)間為2 h，按液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)的條件分別提取香桂精油，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)液料比為20∶1(mL/g)時(shí)，香桂精油得率最大，為4.30%。液料比較小時(shí)，蒸餾水浸泡香桂不夠充分，香桂精油得率小，但是蒸餾水用量太大，會(huì)吸收更多的微波能，使香桂葉吸收微波能下降，導(dǎo)致微波破壞植物細(xì)胞的能力下降，香桂精油得率降低[13]。因此，20∶1(mL/g)為最佳液料比。

圖2 液料比對(duì)香桂精油得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

2.1.2 微波功率的影響

設(shè)定液料比為20∶1(mL/g)，提取時(shí)間為2 h，分別在微波功率為60，70，80，90，100 W的條件下提取香桂精油，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)香桂精油得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

由圖3可知，當(dāng)微波功率為100 W時(shí)，香桂精油得率達(dá)到最高。隨著微波功率的提高，體系的升溫速率加快，細(xì)胞壁迅速破裂，香桂精油大量進(jìn)入萃取介質(zhì)[14]。但是，微波功率太高，加熱速度過(guò)快，會(huì)使原料焦糊，有效成分可能高溫分解，香桂精油得率下降[15]。因此，100 W為微波最佳功率。

2.1.3 提取時(shí)間的影響

設(shè)定液料比為20∶1(mL/g)，微波功率為100 W，分別在提取時(shí)間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h的條件下提取香桂精油，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)香桂精油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of Cinnamomum subavenium essential oil

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，提取率達(dá)到4.43%，之后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，香桂精油得率稍有下降。這是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)，提取時(shí)間增加，物料會(huì)吸收更多的微波能，使植物細(xì)胞充分破裂，香桂精油溶出更多，所以得率上升[16]。但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，有效成分揮發(fā)，使香桂精油得率下降。故適宜的提取時(shí)間為1.5 h。

2.2 SD和MASD提取香桂精油的工藝比較

采用SD提取香桂葉中香桂精油，優(yōu)化其提取工藝，SD和MASD提取香桂精油的優(yōu)化工藝條件見(jiàn)表1。

表1 SD和MASD提取香桂精油的優(yōu)化工藝條件Table 1 Optimized process conditions of Cinnamomum subavenium essential oil extracted by SD and MASD

由表1可知，MASD提取時(shí)間為1.5 h，香桂精油得率為4.43%，比SD提高0.14%，提取時(shí)間減少，提取效率增加。

2.3 香桂精油的化學(xué)成分分析

香桂精油的GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 香桂精油的化學(xué)成分Table 2 Chemical constituents of Cinnamomum subavenium essential oil

續(xù) 表

經(jīng)與Nist標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)照，初步分析鑒定出香桂精油中13 種成分，占色譜總流出峰面積的99.96%，相對(duì)含量最高的化合物是黃樟油素，為98.408%。還有少量的α-蒎烯、檸檬烯、沉香醇、丁子香酚、α-廣藿香等化合物。

2.4 抑菌性能分析

香桂精油對(duì)4種供試菌的最小抑菌濃度(MIC)見(jiàn)表3。

表3 香桂精油對(duì)4種菌株的最小抑菌濃度MICTable 3 MIC of Cinnamomum subavenium essential oil to four strains

注：“+”表示MIC小于 0.78 mg/mL，“-”表示無(wú)明顯抑菌圈。

結(jié)果表明，香桂精油對(duì)4種供試菌均有一定的抑菌效果，其中對(duì)根霉的抑菌活性優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉的抑菌活性。同時(shí)，香桂精油對(duì)真菌的抑制作用優(yōu)于細(xì)菌。此外，香桂精油對(duì)這4種菌的抑制作用均不如青霉素鈉陽(yáng)性對(duì)照組。

3 結(jié)論

本研究采用MASD從香桂葉中提取香桂精油，以香桂精油的得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了其提取工藝。結(jié)果表明：在液料比為20∶1(mL/g)，微波功率為100 W，提取時(shí)間為1.5 h的條件下，香桂精油得率為4.43%。與SD比較，得率提高了0.14%，并大大縮短了提取時(shí)間。采用GC-MS對(duì)香桂精油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，鑒定出 13 種成分，其中黃樟油素含量為98.408%。香桂精油對(duì)4種供試菌均具有一定的抑制作用，其中對(duì)根霉抑制作用最強(qiáng)，MIC為6.25 mg/mL。