朱思遠(yuǎn) ， 徐 巖 ， 喻曉蔚 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫214122；3.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷223814）

黑曲霉被美國食品藥品監(jiān)督局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 定 義 為 基 本 安 全（Generally Recognized As Safe，GRAS)菌株[1]，在食品工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。黑曲霉在工業(yè)酶制劑、有機(jī)酸發(fā)酵方面應(yīng)用廣泛，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要作用[2]。

目前常見的轉(zhuǎn)化絲狀真菌的方法，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、限制酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法[3]等，各有優(yōu)缺點(diǎn)。De Groot等[4]首先將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于絲狀真菌Aspergillus awarmori的轉(zhuǎn)化，并證明了在原核生物和絲狀真菌之間能夠進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)化效率比泡盛曲霉常規(guī)的PEG轉(zhuǎn)化方法提高了600倍。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中通常采用雙元載體，一個是帶有T-DNA的微型克隆質(zhì)粒（mini-Ti載體），一個是帶有Vir區(qū)的輔助質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌將T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞主要是依賴于輔助質(zhì)粒上一系列vir基因的表達(dá)，而這些vir基因的表達(dá)受小分子的酚類和糖類物質(zhì)的雙重調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)物乙酰丁香酮 （acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（hydroxyacetosyringone，OH-AS） 在誘導(dǎo) vir 基因活化過程中起主導(dǎo)作用[5]。一系列毒力蛋白的刺激活化使得在克隆載體上2個邊界的底部鏈重復(fù)區(qū)（RBLB)斷開，導(dǎo)致T-DNA的釋放，并且繼續(xù)在其它毒力蛋白的作用下將T-DNA進(jìn)行運(yùn)輸轉(zhuǎn)移，通過農(nóng)桿菌細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間的接觸，將轉(zhuǎn)移的TDNA靶向細(xì)胞整合到基因組中，從而實(shí)現(xiàn)基因的插入、靶向替換或者敲除的作用[6]，見圖1。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）轉(zhuǎn)化操作簡便，避免了原生質(zhì)體制備過程中復(fù)雜的操作過程及其他方法中的設(shè)備要求[5]；2）轉(zhuǎn)化效率高，并且轉(zhuǎn)化材料可用范圍廣，已有報道利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化可以成功轉(zhuǎn)化分生孢子、菌絲體、原生質(zhì)體及子實(shí)體[7]；3)轉(zhuǎn)化子大部分為單拷貝插入，便于進(jìn)行遺傳分析；4)重組子遺傳穩(wěn)定，同源整合效率高，可用于進(jìn)行絲狀真菌基因靶向敲除，重復(fù)性好，是一種有效的基因靶向工具[8-9]。不同種類的根癌農(nóng)桿菌對于不同物種的侵染效率存在差異，并且不同的轉(zhuǎn)化條件也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的不同[10-11]。與細(xì)菌及酵母等真菌不同的是，絲狀真菌的轉(zhuǎn)化中存在較為嚴(yán)重的假陽性問題，篩選板上生長的轉(zhuǎn)化子并不一定為陽性，所以在優(yōu)化條件獲得較多轉(zhuǎn)化子的同時也需要考慮陽性率。

圖1 克隆質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化絲狀真菌原理Fig.1 Cloning plasmids were transformed to filamentous fungi by Agrobacterium mediation

作者利用2種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉，確定了轉(zhuǎn)化黑曲霉的最適條件，并且分別構(gòu)建了組成型啟動子gpdA與誘導(dǎo)型啟動子glaA表達(dá)同源黑曲霉脂肪酶的載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉，利用羅丹明橄欖油平板初篩[12]，快速確定產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 菌株：黑曲霉CICC2169、CICC2475、CICC2089，農(nóng)桿菌 EHA105、AGL1，大腸桿菌JM109均由作者所在實(shí)驗室保藏。

質(zhì) 粒 ：pCAMBIA1301-gpdA，pCAMPEP，pCAM RCL-glaA由作者所在實(shí)驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（1 L） 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。

2）YEB培養(yǎng)基（1 L） 酵母提取物1 g，蛋白胨5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 0.493 g；pH 7.0，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2 g/dL。

3）PDA培養(yǎng)基 （1 L） 稱取37 gPDA粉末，定容至1 L。

4）IM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （1 L）[13]K2HPO42.05 g，KH2PO41.45 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，CaCl20.066 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 48 g，葡萄糖1.8 g，甘油5 mL，蒸餾水定容至940 mL；在121℃條件下濕熱滅菌20 min，待冷卻至50℃時加入 40 mL、1 mol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES），1 mL、200 mmol/L乙酰丁香酮（AS）。在上述配方中補(bǔ)加瓊脂粉15 g為誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基（IMA），試管液體配方同上，用前加入MES及AS至所需量。

2-（N-嗎啡啉）乙磺酸母液（MES）（1 mol/L）：用天平稱取 19.52 g 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES），加入80 mL蒸餾水，用KOH溶液（5 mol/L）調(diào)節(jié)至 pH 5.3，100 mL容量瓶定容，用0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。

乙酰丁香酮母液 （AS）（200 mmol/L）： 稱取0.196 2 g乙酰丁香酮，用5 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌，-20℃保存

5）羅丹明橄欖油平板（1 L） KCl 0.5 g，K2HPO41 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，葡萄糖 2.5 g，淀粉 2.5 g，麥芽糖2.5 g，橄欖油乳化劑 10 mL，羅丹明母液1 mL（母液 0.01 g/mL）。橄欖油乳化劑為V4%PVA∶V橄欖油=3∶1。

1.1.3 主要試劑 潮霉素hyg、利福平Rif、頭孢噻肟cefo、乙酰丁香酮：購自上海生工公司；Primestar HS、限制性內(nèi)切酶等：購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉潮霉素敏感度測試 利用潮霉素為篩選標(biāo)記，首先對作者所在實(shí)驗室保藏的3株黑曲霉（CICC2169、CICC2475、CICC2089）進(jìn)行潮霉素抗性敏感度測試。配制PDA平板，分別添加潮霉素hyg 抗性， 使終質(zhì)量濃度為 100、200、300、400、500μg/mL。將黑曲霉分別點(diǎn)種到不同hyg抗性的平板上。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的確立及優(yōu)化 圖2所示為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本流程，初始轉(zhuǎn)化條件如下：

圖2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化基本流程示意圖Fig.2 Process of Agrobacterium-mediated transformation

1）黑曲霉孢子準(zhǔn)備 將黑曲霉在平板上培養(yǎng)5 d，使其充分產(chǎn)孢。利用生理鹽水洗下孢子利用4層擦鏡紙過濾，利用血球計數(shù)板計數(shù)，使孢子濃度在107個/mL備用。

2）農(nóng)桿菌準(zhǔn)備與預(yù)培養(yǎng) 將質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化[14]農(nóng)桿菌中，含有雙元載體的農(nóng)桿菌，在平板上劃線活化后轉(zhuǎn)接YEB試管中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至IM+AS試管中使其OD600在0.2左右，培養(yǎng)至OD600為0.7備用。

3）黑曲霉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng) 將準(zhǔn)備好的黑曲霉和農(nóng)桿菌，各取100 μL進(jìn)行充分混合，均勻涂布于含有玻璃紙的IM+AS平板上。置于22℃下避光共培養(yǎng)36 h，轉(zhuǎn)膜至初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初篩培養(yǎng)基上添加潮霉素及頭孢噻肟。初篩板生長的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至復(fù)篩格子板進(jìn)行傳代復(fù)篩。

對以下條件進(jìn)行優(yōu)化：共培養(yǎng)材料（萌發(fā)與非萌發(fā)孢子）、兩種農(nóng)桿菌（AGL1與EHA105）的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮濃度 （0～400 μmol/L）、共培養(yǎng)溫度（17～26 ℃）、農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時的 OD600值（0.5～1.0 以上）、共培養(yǎng)時間（12～72 h）。

1.2.3 脂肪酶表達(dá)載體構(gòu)建 構(gòu)建黑曲霉脂肪酶ANL表達(dá)載體，分別以組成型啟動子甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gpdA）和誘導(dǎo)型啟動子糖化酶基因啟動子（glaA）來啟動脂肪酶基因的表達(dá)。首先基于NCBI對于黑曲霉脂肪酶基因進(jìn)行查找，設(shè)計引物P1-P8，以黑曲霉基因組為模板，擴(kuò)增出包含3段內(nèi)含子的ANL脂肪酶基因序列，后通過重疊延伸PCR去除ANL中的內(nèi)含子序列，將4段ANL拼接，可獲得除去內(nèi)含子的ANL基因。構(gòu)建過程用到的引物見表1。

1）組成型啟動子gpdA表達(dá)載體構(gòu)建 以pCAMPEP質(zhì)粒為載體構(gòu)建組成型表達(dá)載體pCAMANL-gpdA，包括將表達(dá)基因替換為黑曲霉脂肪酶ANL基因，以及將原有潮霉素基因hyg啟動子CaMV35S替換為gpdA，構(gòu)建過程見圖3。

表1 引物表Table 1 Primer table

圖3 pCAMANL-gpdA表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.3 Construction of pCAMANL-gpdA expression vector

2）誘導(dǎo)型啟動子glaA表達(dá)載體構(gòu)建 以pCAMRCL-glaA質(zhì)粒為模板構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體pCAMANL-glaA。將proRCL基因通過ApaI和BglⅡ酶切連接替換為ANL基因，構(gòu)建流程見圖4。其中pCAMRCL-glaA的啟動子PglaA序列是以黑曲霉2475基因組為模板，擴(kuò)增PglaA+glaA信號肽序列，并在信號肽后加入kex2酶切位點(diǎn)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子鑒定 轉(zhuǎn)化子在初篩生長后轉(zhuǎn)至復(fù)篩格子板復(fù)篩，通過復(fù)篩生長的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接土豆葡萄糖試管培養(yǎng)生長，提取基因組進(jìn)行鑒定，黑曲霉基因組提取采用苯酚氯仿抽提法[15]。轉(zhuǎn)化子基因組利用引物P12、P14和引物P12、P15進(jìn)行鑒定，確定是否有目標(biāo)條帶。將轉(zhuǎn)化子接種羅丹明橄欖油平板，初步確定產(chǎn)酶情況。

圖4 pCAMANL-glaA表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.4 ConstructionofpCAMANL-glaA expression vector

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉的潮霉素抗性敏感度測試

利用潮霉素為篩選標(biāo)記，首先對實(shí)驗室保藏的3株黑曲霉CICC2169、CICC2475和CICC2089進(jìn)行了潮霉素抗性敏感度測試，結(jié)果見表2。CICC2475、CICC2089對于潮霉素有著較高的耐受性，對潮霉素不敏感，會導(dǎo)致篩選困難。CICC2169對于潮霉素有較高的敏感度，野生型菌株在200 μg/mL的條件下不生長，因此選擇黑曲霉CICC2169作為轉(zhuǎn)化的宿主菌。

表2 3株黑曲霉潮霉素抗性敏感度測試Table 2 Sensitivity of A.niger to hygromycin B

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉的條件優(yōu)化

將質(zhì)粒pCAMBIA1301-gpdA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得陽性克隆，然后考察陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉的最適條件。分別對于共培養(yǎng)材料的選擇、EHA105農(nóng)桿菌和AGL1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌初始OD值、共培養(yǎng)時間進(jìn)行優(yōu)化，并且從轉(zhuǎn)化子個數(shù)和陽性率2個方面評估最佳條件。

選擇共培養(yǎng)材料，分別以不萌發(fā)的黑曲霉新鮮孢子和剛萌發(fā)孢子進(jìn)行比較，結(jié)果表明，萌發(fā)孢子進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化時，黑曲霉的生長速度明顯快于農(nóng)桿菌，導(dǎo)致后續(xù)篩選中假陽性較高，而以不萌發(fā)孢子為轉(zhuǎn)化材料時，兩者的生長可基本平衡，獲得的轉(zhuǎn)化子90%以上均為陽性轉(zhuǎn)化子，因此后續(xù)實(shí)驗以不萌發(fā)的新鮮孢子為共培養(yǎng)材料。許多已報道的文獻(xiàn)是選擇萌發(fā)的黑曲霉孢子進(jìn)行實(shí)驗[16]，萌發(fā)的孢子已破壁生長，原理上更容易被農(nóng)桿菌侵染，但在本研究中效果并不明顯，而且會導(dǎo)致較高的假陽性。

考察兩種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉的效率。將農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301-gpdA和AGL1/pCAMBIA 1301-gpdA向黑曲霉CICC2169轉(zhuǎn)化。如圖5所示，利用農(nóng)桿菌AGL1獲得的轉(zhuǎn)化子個數(shù)約是利用農(nóng)桿菌EHA105獲得的轉(zhuǎn)化子個數(shù)的14倍。所以，選擇農(nóng)桿菌AGL1進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗。

優(yōu)化了誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮（AS）的濃度，分別為0、100、200、300、400 μmol/L。以 AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，在其他條件相同的情況下，進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見圖6。不添加AS時，沒有獲得轉(zhuǎn)化子，在200 μmol/L和300 μmol/L的條件下轉(zhuǎn)化率都相對較高，且差異不大，因此選擇200 μmol/L為AS誘導(dǎo)濃度。

圖5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率比較Fig.5 Effect of Agrobacterium species on transformation efficiency

圖6 不同濃度AS轉(zhuǎn)化效率比較Fig.6 Effect of concentration of AS in inducing medium on transformation efficiency

對共培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，在AS濃度為200 μmol/L 的條件下，分別以 17、20、23、26 ℃為溫度梯度進(jìn)行共培養(yǎng)。以AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖7。隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化子個數(shù)逐漸增多，但是在利用26℃培養(yǎng)時，孢子萌發(fā)速度較快，黑曲霉生長較快，結(jié)束共培養(yǎng)時已經(jīng)有大量菌絲生長，產(chǎn)生連片現(xiàn)象，后期生長出的轉(zhuǎn)化子有較高的假陽性，因此我們選擇23℃作為共培養(yǎng)溫度。

圖7 共培養(yǎng)溫度優(yōu)化Fig.7 Effect of co-culture temperature on transformation efficiency

對于共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌初始OD600值進(jìn)行優(yōu)化，以AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖8。在AS濃度為200 μmol/L、共培養(yǎng)溫度23℃的條件下，農(nóng)桿菌生長到OD600為0.9～1.0，此時進(jìn)行共培養(yǎng)所獲得轉(zhuǎn)化子個數(shù)較多，并且保持較高的陽性率。

圖8 共培養(yǎng)初始農(nóng)桿菌OD600優(yōu)化Fig.8 Effect of Agrobacterium OD600during co-culture on transformation efficiency

對共培養(yǎng)時間進(jìn)行優(yōu)化，在AS濃度為200 μmol/L，以23℃的共培養(yǎng)溫度，初始農(nóng)桿菌OD600為0.9～1.0 之間，共培養(yǎng)時間設(shè)有 12、24、36、48、60、72 h，結(jié)果見圖9。12 h沒有獲得轉(zhuǎn)化子，在24～48 h內(nèi)，隨著時間的增加轉(zhuǎn)化子個數(shù)逐漸增加，培養(yǎng)60 h和72 h時，共培養(yǎng)結(jié)束時已經(jīng)產(chǎn)生較多（60 h）以及滿板（72 h）的菌絲，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)時轉(zhuǎn)化子個數(shù)不可計，并且陽性率明顯下降，因此選擇48 h為共培養(yǎng)時間。

圖9 共培養(yǎng)時間優(yōu)化Fig.9 Effect of co-culture time on transformation efficiency

實(shí)驗結(jié)果表明，適合CICC2169的轉(zhuǎn)化條件為，不萌發(fā)的新鮮孢子與OD600培養(yǎng)至0.9～1.0的農(nóng)桿菌以1∶1的比例混合后，在AS濃度在200 μmol/L的IM平板上，23℃避光培養(yǎng)48 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。最佳轉(zhuǎn)化效率為（60±5）個轉(zhuǎn)化子/106個孢子，并且陽性率保持在90%以上。

2.3 脂肪酶表達(dá)載體的構(gòu)建

以黑曲霉CICC2475基因組為模板，擴(kuò)增ANL基因1 110 bp，此時基因含有內(nèi)3段含子序列，通過重疊延伸PCR將內(nèi)含子去除，獲得891 bp的片段，結(jié)果見圖10。

圖10ANL基因PCR電泳圖Fig.10 ANL gene

按照以上方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化子構(gòu)建，構(gòu)建完成的轉(zhuǎn)化子利用引物P11，P13進(jìn)行鑒定。挑選條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子測序，結(jié)果正確，黑曲霉脂肪酶基因ANL組成型啟動子pCAMANL-gpdA表達(dá)載體和誘導(dǎo)型啟動子pCAMANL-glaA表達(dá)載體構(gòu)建完成。

2.4 陽性轉(zhuǎn)化子鑒定及轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶初篩

將構(gòu)建完成的2種表達(dá)載體分別通過凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中獲得AGL1/pCAMANL-gpdA和AGL1/pCAMANL-glaA，并利用優(yōu)化后的方法將AGL1/pCAMANL-gpdA和AGL1/pCAMANL-glaA分別轉(zhuǎn)化黑曲霉CICC2169中，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子分別命名glaA-ANL和gpdA-ANL，初篩平板為 PDA+200 μg/mL hyg+100 μg/mL cefo， 復(fù)篩平板為PDA+200 μg/mL hyg，轉(zhuǎn)化子進(jìn)行3次傳代后，提取基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)化子鑒定。glaA-ANL轉(zhuǎn)化子利用引物P12、P15進(jìn)行鑒定，條帶大小為2 111 bp為陽性轉(zhuǎn)化子，gpdA-ANL轉(zhuǎn)化子利用引物P12、P14進(jìn)行鑒定，條帶大小為1 615 bp為陽性轉(zhuǎn)化子，見圖11。

將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至羅丹明橄欖油平板進(jìn)行產(chǎn)酶初篩。對于黑曲霉脂肪酶ANL轉(zhuǎn)化子進(jìn)行羅丹明橄欖油平板鑒定，轉(zhuǎn)化子大多出現(xiàn)了明顯的水解圈，而對照原始菌并沒有紅色水解圈出現(xiàn)，由于插入位置的不同，導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)化子可能有不同的產(chǎn)酶水平。其中組成型啟動子gpdA轉(zhuǎn)化子的水解圈比誘導(dǎo)型啟動子glaA轉(zhuǎn)化子更加明顯，見圖12。

圖11 轉(zhuǎn)化子基因組鑒定Fig.11 Identification of transformants

3 結(jié) 語

在本研究中，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉的共培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定條件為107個/mL不萌發(fā)的新鮮孢子與OD600培養(yǎng)至0.9～1.0的農(nóng)桿菌以 100 μL∶100 μL 的比例混合后，在 AS 濃度在 200 μmol/L的IM平板上，23℃避光培養(yǎng)48 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜至含有頭孢噻肟的初篩平板，其中頭孢噻肟的作用為殺死農(nóng)桿菌，在共培養(yǎng)結(jié)束后及時殺死農(nóng)桿菌，避免由于農(nóng)桿菌過量生長抑制轉(zhuǎn)化子生長。有報道[17]以硝化纖維膜作為膜材料進(jìn)行培養(yǎng)效果最好，但是價格較為昂貴，本過程中以較廉價的轉(zhuǎn)膜材料玻璃紙進(jìn)行直接轉(zhuǎn)膜培養(yǎng)，不采用倒置反貼的過程，不僅縮短農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時間進(jìn)程，還減少了轉(zhuǎn)化子損失。但是宿主菌和農(nóng)桿菌的種類不同，可能會存在不同的轉(zhuǎn)化效率及陽性率[11]。

在進(jìn)行脂肪酶的表達(dá)初試中，采用羅丹明橄欖油平板對于產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了初篩，表達(dá)的脂肪酶通過水解橄欖油產(chǎn)生脂肪酸，脂肪酸會與羅丹明相互作用而顯色，顏色越深并且水解圈越大，表明脂肪酶表達(dá)量越高。轉(zhuǎn)化黑曲霉脂肪酶ANL基因的陽性克隆在平板上有較明顯的顯色，由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化進(jìn)行基因插入的位置是隨機(jī)的，所以可能導(dǎo)致產(chǎn)酶水平存在差異，可以通過轉(zhuǎn)化子顯色圈的顏色和大小進(jìn)行較為直觀的活性篩選。對照菌株本身內(nèi)源產(chǎn)少量脂肪酶，但是由于表達(dá)量過低，并不顯色及產(chǎn)生水解圈。在黑曲霉中進(jìn)行基因的表達(dá)，可能會受到密碼子偏好性、轉(zhuǎn)錄水平或翻譯等不同方面的影響，在接下來的工作中，我們將重點(diǎn)提高目標(biāo)基因的表達(dá)量。