楊 敏， 趙 愷， 濮晶晶， 洪皓飛， 趙鑫銳， 吳志猛

（江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株及質粒 表達宿主Escherichia coli

Endo S（EC 3.2.1.96）是一種來源于化膿鏈球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷內切酶，屬于糖苷水解酶GH18家族。其主要的生物學功能是特異性水解免疫球蛋白G（IgG）可結晶區(qū)（Fc片段）N糖鏈，作用位點為N糖鏈核心五糖中兩個N-乙酰葡萄糖胺之間的糖苷鍵[1]。由于IgG抗體糖基化修飾影響抗體介導的細胞毒作用（ADCC）及補體依賴的細胞毒作用等一系列免疫反應[2-4]，endo S逐步被開發(fā)應用于自身免疫疾病治療[5-7]和抗體糖基修飾功能化改造[8-10]。隨著endo S應用的增多，對其需求量也越來越大，但是目前關于endo S異源表達發(fā)酵優(yōu)化研究較少，在一定程度上限制了endo S的應用。

2001年，Mattias Collin等第一次利用pET30a載體克隆了完整的endo S基因，并在BL21（DE3）pLys中成功表達，但是未實現蛋白質純化，也未對其產量進行報道[1]；隨后該課題組又利用載體pGEX表達了與谷胱甘肽轉移酶 （GST）標簽融合表達的endo S，純化后并把GST標簽切除得到endo S純蛋白質，其表達量未報道[11]；2012年，Wei Huang等報道使用上述表達體系BL21（DE3）-pGEX-GST-endo S在以LB為發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1 mmol/L IPTG、25℃誘導表達16 h后蛋白質產量為40 mg/L發(fā)酵液[9]。同年，Goodfellow等以pGEX-4T-1為載體，BL21（DE3）為宿主表達了密碼子優(yōu)化后的GST-endo S，產量大約10 mg/L發(fā)酵液[12]。2013年，Trastoy等人在C端融合霍亂弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶結構域 （his6-CPD）的載體pCPD上表達endo S，宿主同樣為BL21（DE3），通過鎳柱純化，肌醇六磷酸處理最后得到endo S蛋白，同樣蛋白質表達情況未進行報道[13]。以上關于endo S表達的研究多以獲得蛋白質為目的，未對蛋白質表達進行優(yōu)化且已報道產量不高。

作者構建了endo S外源表達重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-endo S，并在搖瓶水平優(yōu)化重組菌發(fā)酵產酶條件，使endo S表達量得到大幅提升。BL21（DE3）：由作者所在實驗室保存提供；質粒pET28a：購自Novagen有限公司；模板質粒pET30aendo S：由上海藥物所黃蔚課題組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

2）TB培養(yǎng)基 蛋白胨12.0 g，酵母提取物24.0g，甘油4.0 mL，900 mL去離子水溶解后高壓滅菌。冷卻至60℃后，加入100 mL滅菌的含1.7 mol/L KH2PO4和7.2 mol/L K2HPO4的溶液混勻。

3）SOB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉5.0，蛋白胨20.0，NaCl 0.5，KCl 0.2。

4）2×YT培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉10.0，蛋白胨16.0，NaCl 5.0；pH 7.0。

5）SB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉20.0，蛋白胨30.0，MOPS 10.0；pH 7.0。

1.1.3 引物和主要試劑 Endo S基因和pET28a空載擴增引物見表1。質粒提取試劑盒：購自上海生工生物工程有限公司；膠回收試劑盒：購自賽默飛世爾科技；T4DNA聚合酶：購自大連TaKaRa公司；histag蛋白純化磁珠：購自蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司；Nu PAGE預制膠：購自Invitrogen；唾液酸糖肽SGP：自提??；其他試劑：均為進口或國產分析純。

表1 PCR引物Table 1 Primers for endo S and vector cloning

1.2 實驗方法

1.2.1 Endo S基因的克隆及表達載體的構建 以質粒pET30a-endo S為模板，用表1中正反向引物通過PCR擴增endo S基因和pET28a載體。首先用T4 DNA聚合酶消化擴增得到線性載體及目的基因，按表2所示加入反應體系，反應溫度22℃，時間45 min。反應結束后，在上述體系中迅速加入1 μL dCTP（100 μmol/L）混勻終止反應，放置在冰上，加入10 μL退火緩沖液（5×），于PCR儀中退火：75 ℃處理10 min，然后每8秒降低0.1～25℃，退火完成，柱回收。柱回收完成后，限制性內切酶DpnI處理回收片段去除模板質粒，37 ℃反應1 h，轉化預先融化的BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布卡納抗性平板37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選單菌落進行菌落PCR，最后挑選陽性克隆子送至公司測序，將測序正確的菌株制成甘油菌-80℃保存。

表2 T4DNA聚合酶處理反應體系Table 2 Reaction system ofDNA treated with T4 polymerase

1.2.2 糖苷內切酶endo S初步表達 挑取保藏的重組甘油菌接種至液體LB培養(yǎng)基 （含終質量濃度10μg/mL的卡納霉素），37℃、250 r/min過夜培養(yǎng)。將上述種子液以4%接種體積分數接入TB發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、250 r/min培養(yǎng)至OD為0.6， 加入終濃度250 μmol/L的IPTG于30℃誘導12 h。發(fā)酵液9 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入10 mmol/L、pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液（含500 mmol/L NaCl）重懸菌體，碾磨儀破碎，設定程序為：頻率60 Hz，工作1 min間隔30 s，8個循環(huán)。菌體破碎后于4℃、9 000 r/min離心20 min除去菌體碎片，上清液即為粗酶液。蛋白質純化步驟參照BeaverBeadsTM組氨酸標簽蛋白質純化磁珠使用說明書，蛋白質洗脫液利用截留相對分子質量30 000的超濾管（Millipore）進行濃縮脫鹽處理。

1.2.3 菌體生物量測定 采用比色法，將菌液稀釋一定倍數于波長600 nm處測定OD值。

OD600=OD讀數×稀釋倍數。

1.2.4 蛋白質濃度測定 采用考馬斯亮藍法（Bradford）測定蛋白質濃度。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品制作標準曲線。

1.2.5 蛋白質電泳 12 μL蛋白質樣品與4 μL Nu PAGE?LDS Sample Buffer（4×）混合均勻，99 ℃變性10 min。蛋白膠為Nu PAGE預制膠（分離膠質量濃度12 g/dL），電泳緩沖液為pH 7.3的NuPAGE?MES SDS電泳緩沖液，每孔上樣量10 μL，電壓120 V電泳2 h左右。

1.2.6 糖苷內切酶活性鑒定 以唾液酸糖肽SGP為底物，反應體系見表3。37℃反應，HPLC檢測條件為：DIKMA C18-A反向色譜柱 （250 mm×4.6 mm），柱溫40℃，214 nm檢測，梯度洗脫條件見表4。

表3 Endo S催化唾液酸糖肽SGP水解反應體系Table 3 Reaction system of SGP hydrolysis catalyzed by endo S

表4 梯度洗脫條件Table 4 Gradient elution condition

1.2.7 糖苷內切酶endo S表達優(yōu)化

1）基礎培養(yǎng)基篩選 在1.2.2的基礎上，選用5種培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，分別為LB、TB、SB、2×YT和SOB培養(yǎng)基，30℃誘導12 h后，振蕩混勻，測定菌體濃度，取5 mL發(fā)酵液離心收集菌體，800 μL緩沖液重懸，破壁離心，收集上清液，500 μL純化磁珠結合目的蛋白質，洗滌，最后用150 μL體積10 mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液 （含500 mmol/L NaCl和500 mmol/L咪唑）洗脫蛋白質測定表達量。

2）氮源對菌體生長及酶表達的影響 去除基礎培養(yǎng)基中的氮源，分別加入與基礎培養(yǎng)基中氮含量相等的各類氮源（蛋白胨工業(yè)級胰蛋白胨、工業(yè)級牛肉浸膏、酪蛋白、檸檬酸三銨、氯化銨、硫酸銨、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、尿素）進行培養(yǎng)，條件同上。

3）碳源對菌體生長及酶表達的影響 以上述氮源優(yōu)化不加碳源的基礎培養(yǎng)基為對照，加入與初始TB發(fā)酵培養(yǎng)基中碳含量相等的各類碳源 （糊精、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘油）進行培養(yǎng)，條件同上。

4）無機鹽對菌體生長及酶表達的影響 以上述碳氮源優(yōu)化后的基礎培養(yǎng)基設置對照組，再分別在上述優(yōu)化培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的各種無 機 鹽 （CaCl2、CuSO4、FeSO4、CoCl2、MnSO4、LiCl、ZnCl2、MgSO4、NiSO4）進行培養(yǎng)，條件同上。

5）培養(yǎng)基其余組分的影響 以只含優(yōu)化后氮源的培養(yǎng)基作對照，分別加入酵母粉、NaCl和甘油，培養(yǎng)條件同上。

6）發(fā)酵溫度和時間對菌體生長及酶表達影響以上述最終優(yōu)化培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在1.2.2基礎上， 誘導表達溫度設置16、20、26、30、37 ℃共5個梯度， 分別誘導4、8、12、24、36 h后測定菌體量和蛋白質表達量。

7）培養(yǎng)基pH對菌體生長及酶表達的影響 調節(jié)優(yōu)化后培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9，按照1.2.2所述以及上述優(yōu)化發(fā)酵條件進行培養(yǎng)，測定菌體量及蛋白質表達量。

2 結果與分析

2.1 Endo S基因和pET28a載體的克隆

采用特異性引物endo S-F/R、28a-F/R引物，經PCR擴增，成功克隆出長度2 900 bp左右endo S基因和5 300 bp左右的線性載體，對目的條帶進行膠回收并測定回收DNA濃度，回收后片段電泳見圖1。

圖1 PCR擴增產物膠回收電泳圖Fig.1 PCR amplification of DNA

2.2 重組載體的構建

通過不依賴連接反應的克隆方法 （LIC）實現endo S基因與線性載體重組，在沒有dNTP存在情況下，利用了T4 DNA聚合酶3’-5’端的外切酶活性以及大腸桿菌的自我修復機制，具體見圖2?；蚝洼d體等摩爾數混合，T4DNA聚合酶從3'-5'端開始對基因和線性載體上的同源片段進行消化，退火后載體與基因上的同源臂互補配對，形成含有缺口的質粒，轉入大腸桿菌后在大腸桿菌中得到修復形成完整環(huán)狀質粒。通過抗性平板篩選和菌落PCR，將擴增到與目的基因大小一致條帶的陽性克隆送至公司測序分析，測序結果與endo S基因序列一致，說明endoS基因成功連接至pET28a載體。

圖2 質粒構建示意圖Fig.2 Construction of recombinant plasmid

2.3 Endo S表達及純化

重組表達菌株構建完成后，對endo S進行初步誘導表達。設置不添加誘導劑IPTG的空白對照，見圖3。SDS-PAGE分析可以發(fā)現，與endo S大小108 000相吻合的目的條帶，初步表達蛋白質產量大約為50 mg/L發(fā)酵液。

圖3 重組endo S表達SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of endo S expression

2.4 Endo S酶活驗證

唾液酸糖肽SGP是一種來源于雞蛋黃的N糖肽，是endo S天然小分子底物。以SGP為底物驗證endo S的糖苷內切酶活性，反應示意圖見圖4。HPLC檢測反應進程見圖5。反應1 h后保留時間在15.5 min的底物SGP峰1明顯下降，同時在保留時間17.2 min出現一個新峰2，飛行質譜（MALDI-TOF MS）分析該新峰物質相對分子質量為863.286，與SGP糖鏈水解后的產物2理論相對分子質量862.476[M+H]+相符，見圖6，說明表達的endo S具有糖苷內切酶活性。

圖4 Endo S催化SGP水解示意圖Fig.4 Reaction scheme of SGP hydrolysis

圖 5SGP水解HPLC監(jiān)測圖Fig.5 HPLC diagrams of SGP hydrolysis

圖6 產物2 MALDI-TOF質譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS of product 2

2.5 Endo S搖瓶水平表達優(yōu)化

2.5.1 基礎培養(yǎng)基篩選 首先選擇5種基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，分別為LB、TB、SB、SOB和2×YT，對其進行篩選，考察對菌體生長和蛋白質表達的影響，結果見圖7。不同培養(yǎng)基對菌體濃度及蛋白質表達有顯著影響，TB培養(yǎng)基最利于菌體生長，2×YT培養(yǎng)基雖然菌體生長情況沒有TB培養(yǎng)基好，蛋白質表達量卻是5種培養(yǎng)基中最高的，考慮到本研究主要目的是對蛋白質表達量進行優(yōu)化，因此最終選擇2×YT作為基礎培養(yǎng)基。

圖7 基礎培養(yǎng)基篩選Fig.7 Screening of basal mediums

2.5.2 氮源種類優(yōu)化 氮源是微生物主要營養(yǎng)物質之一，是構成生命物質核酸、蛋白質的主要元素。分別在基礎培養(yǎng)基中加入氮含量相等的蛋白胨、工業(yè)級牛肉浸膏、工業(yè)胰蛋白胨、酪蛋白、檸檬酸三銨、氯化銨、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、尿素這十種氮源，菌體生長和蛋白質表達情況見圖8?？梢园l(fā)現相比于菌體生長，氮源種類對蛋白質表達影響更大，有機氮源比無機氮源更有利于蛋白質表達，其中牛肉浸膏作為氮源時蛋白質表達量最高，因此最終選擇牛肉浸膏作為氮源。

圖8 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化Fig.8 Optimization of nitrogen sources

2.5.3 碳源種類優(yōu)化 碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基必不可少的組成成分之一，為菌體生長和蛋白質表達提供碳骨架，微生物細胞碳含量約占其干重的50%。分別在培養(yǎng)基中添加與初始TB發(fā)酵培養(yǎng)基碳含量相等的糊精、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖等一系列碳源，結果見圖9。當以甘油為碳源時，無論是菌體生長情況還是蛋白質表達量，相比其他碳源都具有明顯優(yōu)勢，可能是由于甘油相對于其他碳源更利于菌體吸收，因此選擇添加甘油作為碳源。

圖9 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化Fig.9 Optimization of carbon sources

2.5.4 無機鹽的影響 無機鹽在維持菌體生命活動中扮演著重要的角色，首先它是構成菌體的一般成分，其次它還是一些酶的輔因子，起到調節(jié)酶活性的作用，另外無機鹽還能維持細胞內外滲透壓、調節(jié)pH值等?？紤]到不同目的蛋白表達對無機鹽的需求不一樣，通過在培養(yǎng)基中添加終濃度1 mmol/L的 CaCl2、CuSO4、FeSO4、CoCl2、MnSO4、LiCl、ZnCl2、MgSO4、NiSO4這9種無機鹽考察其對菌體生長和蛋白質表達的影響，結果見圖10。與對照組相比，這幾種無機鹽對菌體生長和蛋白質表達都沒有促進作用，反而存在不同程度的抑制，因此不進行無機鹽的添加。

圖10 培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化Fig.10 Optimization of mineral salts

2.5.5 其他組分的影響 以只含優(yōu)化后氮源的培養(yǎng)基作對照，分別加入其余3種組分酵母粉、甘油和NaCl進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果見圖11?？梢园l(fā)現酵母粉、NaCl和甘油都有利于蛋白質表達量的提高，對于菌體生長，除了NaCl沒有明顯的促進作用，酵母粉和甘油都能有效提高菌體濃度，因此選擇保留上述優(yōu)化培養(yǎng)基中的酵母粉和NaCl，也證明了前面優(yōu)化結果的可靠性。

圖11 培養(yǎng)基其他組分的影響Fig.11 Effect of other components in the medium

2.5.6 發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期的影響 溫度是影響微生物生長代謝的最重要因素之一。在一定范圍內，溫度升高有利于菌體生長繁殖，但是一般來說其最適生長溫度不一定是其生理過程的最適溫度，比如代謝產物的積累。在大腸桿菌蛋白質表達系統(tǒng)中，很多情況下提高誘導表達溫度會導致蛋白質折疊不充分或錯誤折疊而以包涵體的形式出現，適當降低誘導溫度、延長表達時間能夠讓蛋白質在翻譯后有充分的時間進行正確折疊，減少包涵體的形成。進一步考察了誘導溫度和發(fā)酵時間對重組菌生長以及endo S表達的影響，見圖12。菌體生長發(fā)酵時間在12 h之內，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌體濃度整體呈現增長的趨勢。但是當發(fā)酵時間延長，相對高的發(fā)酵溫度如30℃和37℃，反而不利于菌體積累；對于蛋白質表達，適當延長發(fā)酵時間有利于蛋白質的積累，發(fā)酵時間過長，表達的可溶性蛋白質反而減少，在20℃條件下誘導表達24 h酶表達量最高，因此選擇該培養(yǎng)條件作為最終發(fā)酵條件。

圖12 誘導溫度和時間對酶表達量和菌體生長的影響Fig.12 Effectoftemperatureand timeon protein expression and strain growth

2.5.7 發(fā)酵初始pH的影響 為考察培養(yǎng)基初始pH對菌體生長和蛋白質表達的影響，將上述優(yōu)化培養(yǎng)基的pH調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，結果見圖13。 培養(yǎng)基pH值的改變對菌體生長影響不明顯，但是對蛋白質表達影響較大，在pH 8.0時菌體蛋白質表達量最高，當pH值低于7.0或高于8.0，對蛋白質表達都有明顯抑制，說明發(fā)酵培養(yǎng)基過酸過堿都不利于endo S的表達，因此選擇調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值至8.0。

圖13 培養(yǎng)基初始pH的影響Fig.13 Effect of initial pH of cultural medium

2.5.8 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化結果驗證 優(yōu)化前發(fā)酵條件為：TB培養(yǎng)基，30℃誘導12 h，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成如下（g/L）：酵母粉10.0，甘油4.0，牛肉浸膏25.4，NaCl 5.0；pH 8.0，培養(yǎng)條件為20℃誘導表達24 h。分別以兩種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行誘導表達，發(fā)酵結束后純化測定蛋白質表達量，結果見圖14。優(yōu)化后蛋白質表達量為225 mg/L發(fā)酵液，相比優(yōu)化前提高了3.5倍。

圖14 Endo S表達優(yōu)化結果驗證Fig.14 Optimization results of endo S expression

3 結 語

從2001年endo S被發(fā)現可以特異性水解IgG上Fc片段N糖鏈，其逐漸被開發(fā)作為抗體糖基化功能改造工具酶和自身免疫疾病潛在藥物。但近年關于endo S的研究多涉及基礎理論和應用方面，關于表達發(fā)酵優(yōu)化的研究很少，限制了其在抗體藥物改造等方面的應用。因此，作者克隆了化膿鏈球菌來源的endo S基因，構建BL21（DE3）-pET28a-endo S重組表達菌株，并驗證表達蛋白糖苷內切酶活性，在搖瓶水平優(yōu)化蛋白質表達，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分（g/L）：酵母粉10.0，甘油4.0，牛肉浸膏25.4，NaCl 5.0；pH 8.0。最優(yōu)培養(yǎng)條件：20℃誘導表達24 h，最終蛋白質表達量達225 mg/L發(fā)酵液，是優(yōu)化前的4.5倍，同時也是目前報道最高產量的5.6倍。