趙利娜， 李慧芳， 張曉云， 張紅印

（江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

柑橘在采后運(yùn)輸貯藏期間的腐爛大多是由真菌侵染造成的[1-2]，黑腐病（Black rot）、褐腐病（Brown rot）、炭疽?。ˋnthracnose）[3]等通常是采前已經(jīng)開(kāi)始侵染柑橘，采后才發(fā)病。酸腐?。⊿our rot）[1]、青霉?。℅reen mold）、綠霉?。˙lue mold）[4-5]等則是在采摘過(guò)程中及采后發(fā)生侵染。柑橘采后由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）[6]、意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀青霉（Penicillium digitatum）等青霉屬引起的青霉病和綠霉病造成的腐爛最為嚴(yán)重[7]。柑橘的青霉病和綠霉病在柑橘果實(shí)上發(fā)病癥狀較為相似，侵入柑橘后傷口附近變軟，接著長(zhǎng)出白色菌絲體，最后中間部位變?yōu)榍嗌蚓G色，腐爛范圍逐漸擴(kuò)大，直至全果腐爛[8]。

病原菌成功侵染宿主不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程。自然界中寄生能力較強(qiáng)的真菌可直接侵染宿主，或通過(guò)自然孔口進(jìn)行侵染，如茄鏈格抱菌（Alternariasolani）可通過(guò)直接侵入的方式引起馬鈴薯的早疫病[9]。引起柑橘腐爛的P.digitatum、P.italicum等分布范圍較廣，但它們寄生能力較弱，多數(shù)情況下會(huì)潛伏在水果表面，不會(huì)對(duì)水果品質(zhì)造成影響，只有宿主表面出現(xiàn)傷口組織時(shí)才可以完成侵入[10]。因此，在柑橘采后運(yùn)輸貯藏過(guò)程中要盡量避免果實(shí)出現(xiàn)傷口，以減少病原菌侵染的概率。當(dāng)病原菌成功侵入到宿主體內(nèi)后，必須有適宜的溫度、濕度才能生長(zhǎng)繁殖。P.italicum的發(fā)病溫度為23℃，P.digitatum發(fā)病溫度較P.italicum高，在儲(chǔ)藏初期柑橘的腐爛大都由P.italicum引起[11]。儲(chǔ)藏后期溫度逐漸升高，各種病原菌進(jìn)入繁殖的活躍期，協(xié)同發(fā)揮作用。除此之外，病原菌的菌齡也會(huì)影響其侵染宿主的能力，菌株生長(zhǎng)達(dá)到成熟期侵入到宿主體內(nèi)造成的危害遠(yuǎn)大于其它時(shí)期。

P.expansum的寄生能力較弱，通過(guò)宿主的傷口組織侵入后，自身的菌齡以及外界環(huán)境條件如溫度和濕度等都會(huì)影響后續(xù)的侵染速度和發(fā)病程度。Mersha等人研究發(fā)現(xiàn)假尾孢葉斑病（Pseudocercospora fuligena）侵染番茄時(shí)菌齡為7 d的發(fā)病率比21 d的高出50%，在28℃的潮濕環(huán)境中潛育期最短[12]。王翠翠等發(fā)現(xiàn)套袋蘋(píng)果黑點(diǎn)病病原菌 （Alternariatenuissima）在29.4℃時(shí)侵染速度最快[13]。陸寧海等人的研究結(jié)果表明，溫度和濕度持續(xù)時(shí)間對(duì)P.italicum侵染柑橘具有較大的影響[14]。目前對(duì)于柑橘采后病原菌侵染的研究主要以指狀青霉（P.digitatum）[15]和意大利青霉（P.italicum）為主，而對(duì)P.expansum侵染柑橘條件的研究還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期從腐爛柑橘傷口處篩選得到一株致病菌H1，經(jīng)鑒定，確定為擴(kuò)展青霉，命名為P.expansumH1[16]。目前還沒(méi)有菌齡、溫度和濕度等條件影響P.expansum侵染柑橘的報(bào)道，因此，作者對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響因素進(jìn)行了研究，以期為防治P.expansum的侵染提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

電子顯微鏡：購(gòu)于江南光學(xué)儀器廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱：購(gòu)于上海恒一科技有限公司；GR85DR型全自動(dòng)高壓滅菌鍋：購(gòu)于致微（廈門(mén)）儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備有限公司；血球計(jì)數(shù)板：購(gòu)于丹陽(yáng)市健陵醫(yī)療器械公司。試驗(yàn)所用試劑：均購(gòu)于鎮(zhèn)江華東化玻有限公司。

1.2 菌懸液的制備

試驗(yàn)所用菌種P.expansumH1系從江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲生態(tài)果園收集的腐爛柑橘傷口處分離純化得到。將P.expansumH1接種于PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，加水煮沸20 min，過(guò)濾后往濾液中加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min）上活化，25℃培養(yǎng)7 d，用接種環(huán)挑取孢子至無(wú)菌生理鹽水中，振蕩混勻，用無(wú)菌槍頭吸取菌懸液從蓋玻片側(cè)邊滴于血球計(jì)數(shù)板上，吸掉蓋玻片外多余液體，在10×40倍顯微鏡下計(jì)算菌懸液的孢子濃度，調(diào)整孢子濃度至1×106個(gè)/mL備用。

1.3 柑橘果實(shí)

柑橘（廣西蜜桔）選用果園中成熟度一致，外觀色澤大小均一且表面無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，先用清水將柑橘表面塵土等沖掉，再浸入到0.3%的NaClO中殺菌消毒2 min，最后用清水沖洗干凈，室溫下自然晾干。在柑橘赤道位置用滅菌打孔器打3個(gè)相同均勻分布的傷口（5 mm×3 mm）備用。

1.4 溫度對(duì)P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入30 μL濃度為1×106個(gè)/mL的P.expansumH1的菌懸液，2 h后用保鮮膜密封裝有柑橘的筐子，分別置于 4、10、15、20、25、30、35 ℃，95%RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。每個(gè)筐中放12個(gè)柑橘，每個(gè)處理3個(gè)平行，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，逐日觀察統(tǒng)計(jì)潛育期和柑橘腐爛情況。

1.5 保濕時(shí)間對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入30 μL濃度為1×106個(gè)/mL的P.expansumH1的菌懸液，2 h后將浸有5 mL無(wú)菌水的加濕棉球放入裝有柑橘的筐子中。密封后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中。保濕時(shí)間設(shè)置為8、16、24、32、40、48 h，完畢后移去加濕棉球。每個(gè)筐中放12個(gè)柑橘，每個(gè)處理3個(gè)平行，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。逐日統(tǒng)計(jì)腐爛情況和潛育期，每隔24小時(shí)記錄柑橘腐爛情況。

1.6 菌齡對(duì)P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入 30 μL 不同菌齡（3、7、11、15、19 d）濃度為 1×106個(gè)/mL 的P.expansumH1 的菌懸液，密封后放置于25℃、95%RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。每個(gè)筐中放12個(gè)柑橘，每個(gè)處理3個(gè)平行，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，分別在第4、7、10天觀察統(tǒng)計(jì)柑橘腐爛情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件的Student's t檢驗(yàn)或One-Way ANOVA的Tukey’s檢驗(yàn)。P值小于0.05被認(rèn)定為數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

溫度對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見(jiàn)表 1和圖 1-2。由表 1可知，溫度對(duì)于P.expansumH1侵染的速度有較大影響。柑橘在25℃時(shí)35～40 h已經(jīng)開(kāi)始發(fā)病；其次是20℃，潛育期為43～48 h；15℃時(shí)潛育期是67～72 h；10℃和35℃潛育期最長(zhǎng)，為72～77 h（除4℃外）。圖1-2的結(jié)果顯示，25℃時(shí)柑橘的腐爛率和腐爛直徑在48、72、96 h始終高于其他溫度，處于4℃的柑橘在試驗(yàn)期間并未腐爛。48 h時(shí)20、25、30℃柑橘已經(jīng)開(kāi)始腐爛，其它溫度的柑橘并未腐爛。72 h時(shí)所有溫度的柑橘都已腐爛，25℃的柑橘腐爛率達(dá)到90.3%，是35℃的10.8倍，腐爛直徑為12.7 mm （傷口直徑是3 mm），其次是20℃和30℃，腐爛率為 80.6%和72.2%，腐爛直徑為10.9 mm和9.7 mm。96 h時(shí)25℃的柑橘腐爛率高達(dá)98%，幾乎已經(jīng)全部腐爛，腐爛直徑為19.9 mm。以上結(jié)果表明，P.expansumH1在25℃時(shí)潛育期最短，侵染柑橘的能力最強(qiáng)，4℃時(shí)P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。

表1 溫度對(duì)柑橘發(fā)病潛育期的影響Table 1 Effects of temperature on infection incubation period of citrus

圖1 溫度對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.1 Effects of temperature on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖2 溫度對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.2 Effects of temperature on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.2 保濕時(shí)間對(duì)P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

不同保濕時(shí)間對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見(jiàn)圖3-4?？梢钥闯?，濕度對(duì)于P.expansumH1的侵染能力也有很大影響。在第48小時(shí)，保濕時(shí)間為8 h的柑橘腐爛率為12.5%；保濕時(shí)間為48 h的腐爛率高達(dá)86%，腐爛直徑為11.2 mm，是保濕8 h的2倍左右；96 h后保濕8 h的柑橘腐爛率為93%，腐爛直徑是12.4 mm；保濕時(shí)間32 h以上的柑橘腐爛率全部達(dá)到100%，腐爛直徑在16 mm以上，最高達(dá)21.3 mm。從時(shí)間節(jié)點(diǎn)分析，保濕48 h的柑橘腐爛直徑擴(kuò)展的速度較快。以上結(jié)果表明，保濕時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐爛率越高，腐爛直徑越大。

圖3 保濕時(shí)間對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.3 Effects of wetness duration on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖4 保濕時(shí)間對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.4 Effects of wetness duration on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.3 菌齡對(duì)P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

菌齡對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見(jiàn)圖5-6。不同菌齡的P.expansumH1侵染柑橘的能力有較大區(qū)別。培養(yǎng)7 d的P.expansumH1對(duì)柑橘的侵染能力最強(qiáng)，在第4、7、10天的腐爛率和腐爛直徑始終高于其它處理組。第4天時(shí)接種培養(yǎng)7 d的P.expansumH1的柑橘腐爛直徑為11.3 mm，腐爛率已經(jīng)達(dá)到80%，是培養(yǎng)3 d菌株的5倍；第10天時(shí)柑橘腐爛率的大小依次為培養(yǎng)7 d（99.3%）＞培養(yǎng)11 d（88.6%）＞培養(yǎng) 15 d（71.6%）＞培養(yǎng) 19 d（63.7%）＞培養(yǎng)3d（59.3%），且培養(yǎng)7 d的腐爛直徑也最高，為30.2 mm。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d的P.expansumH1侵染能力最強(qiáng)，培養(yǎng)11 d的次之，培養(yǎng)3 d的最弱。值得注意的是，P.expansumH1在培養(yǎng)19 d后雖致病力下降，但依然可以引起柑橘腐爛，具有較強(qiáng)的侵染能力。

圖5 菌齡對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.5 Effects of fungus age on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖6 菌齡對(duì)P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.6 Effects of fungus age on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

3 結(jié) 語(yǔ)

P.expansum可引起柑橘采后綠霉病的發(fā)生，是除P.italicum和P.digitatum外造成柑橘腐爛的另一主要致病菌。作者研究了不同溫度、保濕時(shí)間以及菌齡對(duì)P.expansumH1侵染柑橘能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度、保濕時(shí)間和菌齡對(duì)P.expansumH1侵染柑橘的能力都有很大影響。通過(guò)腐爛率、腐爛直徑及潛育期的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P.expansumH1在25℃時(shí)潛育期最短，侵染柑橘的能力最強(qiáng)，4℃時(shí)P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。同時(shí)，保濕時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐爛率越高，腐爛直徑越大。此外，培養(yǎng)7 d的P.expansumH1侵染柑橘的能力最強(qiáng)。陸寧海等的研究發(fā)現(xiàn)，P.italicum的菌齡和外界環(huán)境條件如溫度、保濕時(shí)間都會(huì)影響柑橘青霉?。≒.italicum）的發(fā)病[14]，本研究結(jié)果與其基本一致。菌齡為7 d的P.expansumH1在25℃、保濕時(shí)間48 h時(shí)最適宜侵染柑橘發(fā)病，說(shuō)明該菌侵染需要較高的溫度和較長(zhǎng)的保濕時(shí)間。培養(yǎng)3 d的菌株致病性較弱，可能是由于培養(yǎng)時(shí)間較短，P.expansumH1致病能力不足。柑橘在長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中溫度和濕度都會(huì)升高，為P.expansum的侵染提供了有利的條件，這可能是近年來(lái)P.expansum引起的柑橘采后病害日益嚴(yán)重的原因。因此在柑橘采后運(yùn)輸貯藏過(guò)程中應(yīng)及時(shí)通風(fēng)降溫除濕，以有效控制P.expansum的生長(zhǎng)繁殖。