劉 艷， 張 婷， 闞婷婷， 李劍芳， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖 （xylan）是半纖維素的重要組成成分，是一種重要的可再生生物資源[1]。內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶簡(jiǎn)稱為木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8），能夠水解木聚糖分子主鏈內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，廣泛應(yīng)用于食品、造紙和飼料等領(lǐng)域[2]。

迄今為止，已有多種不同來源的木聚糖酶基因在大腸桿菌 （Escherichia coli）、畢赤酵母（Pichia pastoris）和乳酸克魯維酵母 （Kluyveromyces lactis）等宿主菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[3-5]。不同來源的木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)各有不同，研究發(fā)現(xiàn)天然存在的木聚糖酶極少可以兼具高活性和高耐熱性。因此，越來越多的研究者對(duì)木聚糖酶進(jìn)行分子改造以期獲得酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的工業(yè)化木聚糖酶[6-8]。目前對(duì)于木聚糖酶的分子改造研究主要集中在對(duì)酶的耐熱性改造方面[9-11]。然而，大多數(shù)改造后的木聚糖酶在耐熱性提高的同時(shí)伴隨著活性的下降，這在一定程度上限制了耐熱木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用[12-14]。因此，一些研究者開始以耐熱性較高的天然木聚糖酶為出發(fā)菌株，通過基因突變來提高其酶活性，以期獲得耐熱性和活性俱佳的突變木聚糖酶[15-16]。羅建杰等[17]利用PCR方法將木聚糖酶XYN-W的C端57個(gè)氨基酸序列去除，比活性提高了43.9%。王謙等[18]對(duì)木聚糖酶ATX活性位點(diǎn)附近的單一氨基酸實(shí)施定點(diǎn)突變（L49P）來增強(qiáng)木聚糖酶的活性，Kcat/Km值較原酶提高了51.7%。雖然很多研究者通過基因突變技術(shù)對(duì)木聚糖酶進(jìn)行了分子改造并取得了一定的成果，但仍未能達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的水平，改善木聚糖酶催化特性的分子改造研究還有待進(jìn)行。

作者所在實(shí)驗(yàn)室從米曲霉基因組中克隆了一個(gè)木聚糖酶基因Aoxyn11A，并通過N端替換提高了該酶的熱穩(wěn)定性，突變酶AEx11A的最適溫度高達(dá)75℃，比原酶高25℃，70℃的半衰期t1/270由原酶的1 min提高為197 min，但比活性下降為原酶的63%，一定程度上限制了木聚糖酶AEx11A在工業(yè)中的應(yīng)用。為改善木聚糖酶AEx11A的催化特性，本研究基于生物信息學(xué)分析結(jié)果，擬對(duì)AEx11A中編碼 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132的密碼子實(shí)施飽和突變，構(gòu)建飽和突變文庫(kù)，并從中獲得表達(dá)酶活性最高的突變子。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

表達(dá)宿主E.coliBL21（DE3）：購(gòu)自Invitrogen公司；重組質(zhì)粒pET-28a-AEx11A：作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

rTaqDNA聚合酶、高保真PrimeSTAR、DNA和蛋白質(zhì)Marker：購(gòu)自TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨：購(gòu)自Sangon公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、樺木木聚糖：購(gòu)自Sigma公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，121℃高溫滅菌20 min；LB固體培養(yǎng)基：加入瓊脂18 g/L到LB液體培養(yǎng)基中，121℃高溫滅菌20 min；LB抗性培養(yǎng)基：添加終質(zhì)量濃度達(dá)100 μg/mL的卡那霉素。

1.3 木聚糖酶的同源建模及分子對(duì)接

選擇與木聚糖酶AEx11A一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性較高，來源于E.coli的木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB：2VGD） 為 模 板 ， 運(yùn) 用 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬。使用ChemDraw 3D Ultra 12.0構(gòu)建XYN （木二糖）的三維結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化。以AEx11A的三維結(jié)構(gòu)為受體， 運(yùn)用 AutoDock 4.2（http：//autodock.scripps.edu）程序，將底物XYN對(duì)接至酶活性中心的合適位置。采用PyMOL （http：//pymol.org/）分析對(duì)接后AEx11A的三維結(jié)構(gòu)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

基于AEx11A一級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分析，擬在AEx11A 的 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。依據(jù)AEx11A核苷酸序列及目的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，由Sangon上海公司合成，見表1。

表1 飽和突變的引物Table 1 PCR primers for the saturation mutation

1.5 突變文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

以pET-28a-AEx11A為模板，T98X-F、N100XF、V124X-F、P129X-F 和 I132X-F 為上游引物，T7-R為下游引物，采用全質(zhì)粒PCR（whole-plasmid PCR） 對(duì) Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132密碼子實(shí)施飽和突變，將PCR產(chǎn)物用DpnⅠ消化，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），構(gòu)建飽和突變文庫(kù)。每個(gè)突變點(diǎn)從平板上挑選97個(gè)轉(zhuǎn)化子 （E.coli/AEx11AT98X、E.coli/AEx11AN100X、E.coli/AEx11AV124X、E.coli/AEx11AP129X和E.coli/AEx11AI132X，X代表任意氨基酸），接種于1 mL LB抗性培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，以2%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至1 mL相同的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí)，加入0.5 mmol/L IPTG、28℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，4℃、8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入 200 μL、1 mg/mL溶菌酶溶液后，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心后收集上清液即為粗酶液。將酶液適當(dāng)稀釋后取5 μL加入95 μL 0.5 g/dL樺木木聚糖溶液（pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液）中，借助PCR儀進(jìn)行催化和顯色反應(yīng)（75 ℃ 10 min，加 50 μL DNS 試劑，95 ℃ 5 min，冷卻至10℃），加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD540值。酶活性大于原酶30%的突變木聚糖酶所對(duì)應(yīng)的突變子定義為正突變子，對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序。對(duì)其中酶活性提高較明顯的位點(diǎn)進(jìn)行迭代飽和突變，DNS法篩選最優(yōu)突變子。

1.6 木聚糖酶的表達(dá)和純化

將原酶和篩選得到的突變酶分別接種于含100 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體。加入適當(dāng)破碎液（pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液）重懸菌體，冰浴條件下，超聲波破碎細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心收集上清液，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取上清液加樣至Ni-NTA親和層析柱（北京Tiandz公司），以純化目的酶蛋白。

1.7 木聚糖酶的活性測(cè)定及蛋白質(zhì)分析

采用DNS法[19]測(cè)定木聚糖酶活性，通過SDSPAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物；Bradford法[20]測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.8 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.8.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 將適當(dāng)稀釋的酶液于60～85℃下反應(yīng)，每隔5℃測(cè)定酶活性，以最高者為100%，作溫度-相對(duì)酶活性曲線。將酶液于最適溫度保溫不同時(shí)間，每隔一段時(shí)間測(cè)定殘余酶活，以未經(jīng)保溫處理酶液的酶活性定義為100%，作時(shí)間-相對(duì)酶活性曲線。當(dāng)殘余酶活達(dá)到80%以上即定義為穩(wěn)定。反應(yīng)所使用的緩沖液為pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。

1.8.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 將適當(dāng)稀釋的酶液在pH 3.5～7.5下于最適溫度反應(yīng)，每隔0.5個(gè)pH測(cè)定酶活性，以最高者為100%，作pH-相對(duì)酶活性曲線。將酶液在不同pH值下于最適溫度保溫1 h，測(cè)定殘余酶活，以最高者為100%，作pH-相對(duì)酶活性曲線。當(dāng)殘余酶活達(dá)到80%以上即定義為穩(wěn)定。反應(yīng)所使用的緩沖液為50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH 3.0～8.0）。

1.8.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 以不同質(zhì)量濃度 （1.0～10.0 mg/mL）的木聚糖溶液（pH 5.5）為底物，在木聚糖酶最適條件下測(cè)定酶活性，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算酶的kcat及kcat/Km值。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的選定

通過搜索蛋白質(zhì)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與木聚糖酶AEx11A的蛋白質(zhì)序列一致性為76%的木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu) （PDB：2VGD），以 2VGD為模板，利用SWISS-MODEL對(duì)木聚糖酶AEx11A進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，對(duì)模擬后的AEx11A進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果見圖1。催化中心Glu89和Glu180位于底物結(jié)合口袋處。通過對(duì)AEx11A的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行保守性分析和氨基酸位置及理化性質(zhì)分析，篩選出5個(gè)待突變的位點(diǎn)，分別為 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132。

2.2 突變文庫(kù)的構(gòu)建和最優(yōu)突變子篩選

按照1.5的方法，構(gòu)建飽和突變文庫(kù)，DNS法篩選酶活性提高的突變子。結(jié)果顯示，從E.coli/AEx11AT98X突變文庫(kù)中篩選出6個(gè)酶活性大于原酶30%的轉(zhuǎn)化子，選出酶活性最好的3個(gè)轉(zhuǎn)化子測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果表明，這3個(gè)轉(zhuǎn)化子均表達(dá)出AEx11AT98D。從E.coli/AEx11AV124X突變文庫(kù)中篩選出4個(gè)酶活性大于原酶30%的轉(zhuǎn)化子，選出酶活性最好的3個(gè)轉(zhuǎn)化子測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果表明，這3個(gè)轉(zhuǎn)化子均表達(dá)出AEx11AV124T。 而E.coli/AEx11AP129X、E.coli/AEx11AI131X和E.coli/AEx11AI132X突變文庫(kù)中沒有篩選出酶活性提高30%的轉(zhuǎn)化子。以pET-28a-AEx11AT98D為模板，在Val124位點(diǎn)實(shí)施迭代飽和突變，篩選得到最優(yōu)轉(zhuǎn)化子E.coli/AEx11AT98D-V124Q。

圖1 AEx11A的三維結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)Fig.1 Three-dimensional structure of AEx11A

2.3 木聚糖酶的表達(dá)和純化

重 組 菌E.coli/AEx11A、E.coli/AEx11AT98D、E.coli/AEx11AV124T和E.coli/AEx11AT98D-V124Q及對(duì)照E.coli/pET-28a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和超聲波破碎后，測(cè)定上清液的酶活性。結(jié)果表明，重組AEx11AT98D、AEx11AV124T、AEx11AT98D-V124Q的粗酶液酶活性依次為77.95、58.86、97.13 U/mL，分別是 AEx11A（30.90 U/mL）2.52、1.90、3.14倍。將上清液采用Ni-NTA柱純化，AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q對(duì)木聚糖的比活性依次為 1 451.6、1 120.5、1 859.4 U/mg，分別為 AEx11A （612.3 U/mg） 的 2.37、1.83、3.04 倍。SDS-PAGE分析顯示，純化后的AEx11A、AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q均約在相對(duì)分子質(zhì)量26 200處呈現(xiàn)單一條帶，見圖2。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 溫度對(duì)木聚糖酶活性的影響 采用DNS法測(cè)定不同溫度下（60～85℃）的酶活性，結(jié)果見圖3。AEx11A與各突變酶的最適溫度均為75℃，AEx11A在 75℃的半衰期t1/275為 174 min，與AEx11AT98D（179 min） 和AEx11AT98D-V124Q（188 min）相差不大， 而 AEx11AV124T的t1/275為270 min，是AEx11A的1.55倍，熱穩(wěn)定性稍高于AEx11A。

2.4.2 pH對(duì)木聚糖酶活性的影響 采用DNS法測(cè)定酶液在不同pH值下的酶活性，結(jié)果見圖4。AEx11A與各突變酶的最適pH均為6.0，pH穩(wěn)定性基本無差異。AEx11A和AEx11AV124T在pH 5.0～7.5之間保持穩(wěn)定，AEx11AT98D在pH 5.0～6.5之間保持穩(wěn)定，AEx11AT98D-V124Q在pH 5.0～7.0之間保持穩(wěn)定。

圖3 木聚糖酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.3 Temperature optimum and thermostability of xylanase

2.4.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 AEx11A、AEx11AT98D、AEx11AV124T和AEx11AT98D-V124Q的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。突變酶的Km值與原酶相比均有所下降，對(duì)底物的親和力增強(qiáng)。催化效率kcat/Km值存在明顯的不同，AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q的kcat/Km值分別為AEx11A的2.02、1.49和2.74倍。表3列出了一些GH11家族木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，最優(yōu)突變子AEx11AT98D-V124Q的Km值與其它GH11家族木聚糖酶相比較低，且催化效率kcat/Km值處于較高水平，這可能是由于有效的突變使得酶與底物的親和力增強(qiáng)。

圖4 木聚糖酶的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 pH optimum（a） and pH stability（b） of xylanase

表2 木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of xylanase

3 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)木聚糖酶AEx11A進(jìn)行了蛋白質(zhì)水平的改造， 通過對(duì) AEx11A 中編碼 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和Ile132的密碼子實(shí)施飽和突變，采用DNS顯色法篩選得到2個(gè)酶活性提高明顯的突變子AEx11AT98D和AEx11AV124T，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行迭代飽和突變，篩選得到最優(yōu)突變子AEx11AT98D-V124Q。純化后突變酶 AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q的比活性分別為AEx11A的2.37、1.83和3.04倍。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，突變酶AEx11AV124T的熱穩(wěn)定性較AEx11A有一定提高，各突變酶的pH特性與AEx11A差異不大。突變酶的Km值與AEx11A相比均下降，對(duì)底物的親和力增強(qiáng)，AEx11AT98D、AEx11A124T和AEx11AT98D-V124Q的催化效率分別為AEx11A的2.02、1.49和2.74倍。該研究表明，Thr98和Val124位點(diǎn)的分子改造能夠有效改善AEx11A的催化特性，為以后木聚糖酶的進(jìn)一步改造奠定了理論基礎(chǔ)。

表3 GH11家族木聚糖酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 3 Comparison of the kinetic parameters of several GH11 family xylanases