馬文龍 ， 劉延峰 ， 呂雪芹 ， 李江華 ， 劉 龍 ， 堵國(guó)成 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

N-乙酰氨基葡萄糖 （N-acetyl-glucosamine，GlcNAc），又稱為2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是一種具有生物活性的氨基單糖。GlcNAc及其衍生物 （氨基葡萄糖，N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸和1，6-脫水N-乙酰胞壁酸）在藥品和保健品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如因其具有消炎和抗腫瘤的作用，與硫酸軟骨素組合使用替代塞來(lái)昔布治療關(guān)節(jié)炎，可以避免塞來(lái)昔布的副作用；作為膳食補(bǔ)充劑，可以增強(qiáng)人的免疫力[1-3]。另外，研究表明GlcNAc作為藥物輔料，由于其溶解性好，安全性高，無(wú)副作用，可以作為化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移磁共振成像對(duì)比劑應(yīng)用于腫瘤診斷[4-5]。而且，利用氨基葡萄糖將金納米顆粒-石墨烯氧化物官能化后，可以降低非特異性毒性，提高抗菌活性，將其作為一種有效的抗菌劑，在制造醫(yī)療器械和廢水處理中具有良好的應(yīng)用潛力[6-7]。

在之前的研究中，我們通過(guò)阻斷重組枯草芽孢桿菌中心碳代謝副產(chǎn)物乙偶姻溢流，得到GlcNAc高產(chǎn)菌株BSGN10，其在3 L發(fā)酵罐中恒pH補(bǔ)料分批發(fā)酵，GlcNAc產(chǎn)量可達(dá)48.9 g/L[8]。然而在搖瓶發(fā)酵中，由于乙酸的積累，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)和GlcNAc合成，限制了后續(xù)菌株改造。解決乙酸溢流的方法有許多，如強(qiáng)化內(nèi)源乙酰CoA合成酶 （編碼基因acsA）或異源琥珀酰-CoA-乙酸CoA轉(zhuǎn)移酶（編碼基因aarC）表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞同化乙酸的能力，將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA，為GlcNAc合成提供乙?；w；雖然該方法可以減弱乙酸毒性，但由于琥珀酰-CoA在反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為琥珀酸，琥珀酸（pKa=4.21）與乙酸（pKa=4.75）具有相近的解離常數(shù)，琥珀酸的積累也會(huì)產(chǎn)生毒性[9-10]；而且該方法可能會(huì)形成乙酸—乙酰-CoA—乙酸之間的無(wú)效循環(huán)，從整體經(jīng)濟(jì)性考慮，這不是解決乙酸溢流的較優(yōu)策略。也可以異源表達(dá)異檸檬酸裂解酶（編碼基因aceB）和蘋(píng)果酸合酶（編碼基因aceA）構(gòu)建乙醛酸循環(huán)體，減少乙酸生成，但乙醛酸循環(huán)體與GlcNAc合成途徑競(jìng)爭(zhēng)前體AcCoA，不利于GlcNAc合成[11]。由于乙酸可以經(jīng)乙酰輔酶A（Ac-CoA）合成酶AcsA催化生成Ac-CoA，為GlcNAc的合成提供前體，所以為了促進(jìn)GlcNAc的合成和乙酸的利用，作者對(duì)AcsA的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控，見(jiàn)圖1。

已有研究表明，全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY通過(guò)結(jié)合到acsA 5′UTR區(qū)域阻礙轉(zhuǎn)錄，抑制酶AcsA的表達(dá)[12-17]；而且AcsA翻譯后在K549位點(diǎn)受乙?；揎椂Щ頪18-19]。為了提高酶AcsA的表達(dá)量和活性，作者首先對(duì)CodY結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了突變，以解除全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY對(duì)acsA轉(zhuǎn)錄的抑制；在此基礎(chǔ)上，對(duì)AcsA549位的Lys進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，解除乙?；揎?。通過(guò)以上改造，使得acsA的轉(zhuǎn)錄水平提高了43%，AcsA胞內(nèi)比酶活提高到66.7 mU/mg。最終在搖瓶發(fā)酵中乙酸積累量降低至3.6 g/L，相比出發(fā)菌株降低了43%；同時(shí)GlcNAc產(chǎn)量提高到5.0 g/L，相比出發(fā)菌株提高了163%。該研究思路與方法為解決枯草芽孢桿菌乙酸溢流提供了借鑒，為進(jìn)一步提高GlcNAc產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

圖1 重組枯草芽孢桿菌中GlcNAc合成途徑及乙酸代謝途徑Fig.1 Synthetic pathway of GlcNAc and metabolism pathway of acetate in Bacillus subtilis

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究所用的菌株和質(zhì)粒詳見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑 Prime STAR （max）DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4 DNA連接酶以及定量PCR試劑盒：購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和DpnI：購(gòu)自Thermo公司；酵母粉和蛋白胨：購(gòu)自O(shè)xoid公司；其他常規(guī)試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成及測(cè)序：均由上海生工有限公司完成。實(shí)驗(yàn)中，博來(lái)霉素、卡那霉素和氨芐青霉素的添加質(zhì)量濃度分別為 25、25、100 μg/mL。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，葡萄糖60，磷酸氫二鉀15，硫酸鎂3，七水硫酸亞鐵0.06，無(wú)水氯化鈣 0.06。

表1 本文所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒pcreK的構(gòu)建 pcreK構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。首先以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模板，以pcrek-L-F和pcrek-L-R為引物，擴(kuò)增得到creK-L；再將質(zhì)粒p7Z6用限制性快切酶EcoR I線性化；然后以膠回收后的creK-L為大引物，以EcoR I線性化的質(zhì)粒p7Z6為模板擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化E.coliJM109，次日用引物pcrek-L-F/pcrek-L-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并挑取條帶大小約2 000 bp的克隆子測(cè)序確認(rèn)[21]。其次，以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模板，以pcrek-R-F和pcrek-R-R為引物，擴(kuò)增得到creK-R；然后以膠回收后的creK-R為大引物，直接擴(kuò)增上述得到的陽(yáng)性克隆子，PCR產(chǎn)物經(jīng) DpnI消化后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，次日用引物pcrek-R-F/pcrek-R-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并挑取條帶大小約850 bp的克隆子測(cè)序確認(rèn)，得到質(zhì)粒pcreK。所用引物序列見(jiàn)表2。

1.2.2 acsA 5′UTR區(qū)域內(nèi)CodY結(jié)合位點(diǎn)的突變首先，在質(zhì)粒上對(duì)CodY結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)突變。以質(zhì)粒pcreK為模板，選取適當(dāng)引物，按照Quik Change Site-directed Mutagenesis kit進(jìn)行定點(diǎn)突變。然后，挑取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆子，以引物對(duì)CreKL-F/CreK-L-R擴(kuò)增后柱回收PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化BSGN10，對(duì)基因組上相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行突變。

1.2.3 AcsA K549飽和突變 AcsA K549飽和突變采用兼并引物的方式進(jìn)行。首先，以pcreK為模板，以K549-F/K549-R為引物，在質(zhì)粒上對(duì)AcsAK549進(jìn)行飽和突變。然后，挑取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆子，以引物對(duì)CreK-L-F/CreK-L-R擴(kuò)增后柱回收PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化BSGN10，對(duì)基因組上相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行突變。

1.2.4 GlcNAc搖瓶發(fā)酵 種子培養(yǎng)：挑取平板上新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落接種到25 mL LB液體培養(yǎng)基（250mL平底三角瓶）中于37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)8～10 h。

圖2 pcreK質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of plasmid pcreK

搖瓶發(fā)酵：將種子液按接種體積分?jǐn)?shù)5%接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中 （250 mL擋板三角瓶），在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.5 檢測(cè)方法 發(fā)酵液中GlcNAc、乙酸和葡萄糖質(zhì)量濃度用HPLC檢測(cè)[8]；乙酰輔酶A合成酶活性通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)液中NADH吸光值的變化測(cè)定[22]；蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用碧云天Bradford試劑盒測(cè)定。

表2 本文所用的引物及序列Table 2 Primers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 CodY結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)acsA轉(zhuǎn)錄和乙酸積累的影響

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY在革蘭氏陽(yáng)性菌中非常保守，其通過(guò)感知胞內(nèi)GTP和支鏈氨基酸濃度，感知胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化，通過(guò)改變對(duì)不同結(jié)合位點(diǎn)的親和力，改變對(duì)不同基因的結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)和胞內(nèi)碳氮代謝流分配，適應(yīng)胞外環(huán)境的變化[12，15，17]。 如圖 3（a）所示，在acsA5’UTR 區(qū)域內(nèi)，CodY結(jié)合序列為tATaTTtTaAAAATT（小寫(xiě)堿基表示與保守序列的差異；CodY結(jié)合回文保守序列為AATTTTCWGAAAATT，紅色堿基表示最保守的堿基）[14]。Belitsky B R和Sonenshein A L通過(guò)突變保守的A10，解除了CodY對(duì)ispA、rapA和rapE的抑制[17]。作者在借鑒Belitsky B R和Sonenshein A L研究的基礎(chǔ)上，對(duì)回文序列中A10、A10-A11及對(duì)應(yīng)的T6及T5-T6進(jìn)行了突變，以減弱CodY的結(jié)合，并將t7、a9分別突變?yōu)镃7、G9，以增強(qiáng)CodY的結(jié)合，作為對(duì)照。

如圖3（b）所示，將保守堿基突變?yōu)槠渌麎A基均不同程度地促進(jìn)了基因acsA的轉(zhuǎn)錄。其中，最保守堿基A10突變效果尤其明顯，突變株CodY-5和CodY-6中acsA轉(zhuǎn)錄水平分別提高了35%和43%，同時(shí)乙酸積累量分別降低了15%和23%，為5.5 g/L和 5.2 g/L。雖然 T6、T5-T6 與 A10、A10-A11 在回文序列中處于對(duì)應(yīng)的位置，但是突變后效果并不明顯，CodY-1和CodY-2中acsA轉(zhuǎn)錄水平僅僅提高了5%和12%，乙酸積累量也僅僅降低了5%和8%，為6.4 g/L和6.2 g/L。同時(shí)，將非保守堿基t7、a9分別突變?yōu)楸Ｊ氐腃7、G9后，對(duì)acsA轉(zhuǎn)錄和乙酸利用都沒(méi)有明顯的影響?；谝陨戏治觯x擇突變株CodY-6進(jìn)行下一步的改造。

圖3 CodY結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)acsA轉(zhuǎn)錄和乙酸積累的影響Fig.3 Effects of CodY binding sequences mutation on acsA transcription and acetate accumulation

2.2 AcsAK549飽和突變對(duì)AcsA酶活和乙酸積累的影響

乙酰化與磷酸化類似，調(diào)控著生物體內(nèi)許多重要的生理功能，如受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA處置和代謝控制等[23-24]。如圖4（a）所示，枯草芽孢桿菌乙酸利用途徑也受乙?；{(diào)控，該途徑中的關(guān)鍵酶AcsA在其Lys549位點(diǎn)被乙酰基轉(zhuǎn)移酶AcuA乙?；?，導(dǎo)致其活性喪失，利用乙酸的能力降低。雖然在大腸桿菌中已有通過(guò)調(diào)控AcsA表達(dá)促進(jìn)乙酸利用的報(bào)道，但是在枯草芽孢桿菌中很少有相關(guān)的報(bào)道[22，25]。

為了探究AcuA乙?；瘜?duì)乙酸利用的影響，作者對(duì)其乙?；稽c(diǎn)進(jìn)行了突變。如圖4（b）所示，將Lys549突變?yōu)槠渌?9種氨基酸雖然可以解除乙?；揎?，但是由于不同氨基酸其空間位阻或者帶電荷性質(zhì)的不同，對(duì)酶AcsA活性和乙酸利用的影響也不盡相同。將Lys549突變?yōu)閴A性氨基酸Arg或者His，對(duì)乙酸利用沒(méi)有明顯影響；而將Lys549突變?yōu)樗嵝园被幔ˋsp，Glu）或極性中性氨基酸（Cys，Met，Gln，Asn，Ser，Thr，Trp，Tyr），不利于乙酸利用；當(dāng)將Lys549突變?yōu)榉菢O性氨基酸Gly和Pro時(shí)，明顯促進(jìn)乙酸利用，乙酸積累量分別減少了25%和19%，為3.6 g/L和4.0 g/L。乙酸積累量的減少，說(shuō)明通過(guò)突變解除乙酰化修飾后，提高了酶AcsA的活性。如圖4所示，將Lys549突變?yōu)镚ly后胞內(nèi)比酶活為66.7 mU/mg，相比BSGN10-CodY6提高了44%，相比出發(fā)菌株BSGN10提高了76%。

2.3 GlcNAc搖瓶發(fā)酵

雖然以上研究表明，通過(guò)促進(jìn)乙酸利用途徑中AcsA轉(zhuǎn)錄以及通過(guò)解除乙?；揎椏梢蕴岣逜csA的活性，促進(jìn)乙酸的利用，但是其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物GlcNAc合成的影響仍然未知。為了考察調(diào)控AcsA表達(dá)對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)GlcNAc性能的影響，挑選乙酸產(chǎn)量顯著降低的菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，與出發(fā)菌株BSGN10進(jìn)行了比較。

如圖 4（d）所示，發(fā)酵 30 h后，菌株 BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G的GlcNAc產(chǎn)量分別為3.2 g/L和5.0 g/L，是出發(fā)菌株BSGN10的1.7和2.6倍；同時(shí)菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodyY-AcsAK549G的生物質(zhì)積累量（DCW）分別為 3.5 g/L和 5.3 g/L，是出發(fā)菌株BSGN10的1.3和1.9倍。以上結(jié)果表明，調(diào)控AcsA表達(dá)不但可以促進(jìn)乙酸利用，而且可以提高菌株的發(fā)酵性能。

3 結(jié)語(yǔ)

增強(qiáng)枯草芽孢桿菌對(duì)乙酸的利用能力，提高其發(fā)酵性能，對(duì)于代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)高附加值的生物化學(xué)品具有重要的意義。已有研究通過(guò)在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建乙醛酸循環(huán)，促進(jìn)Ac-CoA與乙醛酸縮合生成蘋(píng)果酸，通過(guò)促進(jìn)Ac-CoA的消耗，促進(jìn)乙酸的利用[11]。但是對(duì)于GlcNAc的生產(chǎn)而言，由于需要Ac-CoA為GlcNAc提供乙?；瑯?gòu)建乙醛酸循環(huán)會(huì)減少Ac-CoA的供給，不利于GlcNAc的合成。由于Ac-CoA合成酶AcsA以乙酸為底物，催化其轉(zhuǎn)化為Ac-CoA，可以為GlcNAc提供乙?；源龠M(jìn)酶AcsA的表達(dá)不但可以提高菌株利用乙酸的能力，而且可以提高其發(fā)酵產(chǎn)GlcNAc的性能。由于GlcNAc的合成消耗Ac-CoA，可以促進(jìn)乙酸的利用，為了進(jìn)一步提高重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)GlcNAc的能力，后續(xù)研究將通過(guò)強(qiáng)化GlcNAc合成途徑中關(guān)鍵酶GNA1和GlmS的表達(dá)，加強(qiáng)Ac-CoA的消耗，繼續(xù)減少或消除乙酸積累。

圖4 AcsAK549飽和突變對(duì)乙酸積累、AcsA酶活和GlcNAc合成的影響Fig.4 Scheme of the AcsA acetylation and its effects on acetate utilization and GlcNAc production