潘 迪,張大革,孫運(yùn)金,馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

等離子體殺菌技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一項新的物理殺菌技術(shù),相對于其他滅菌方法,低溫等離子體的突出特點(diǎn)是操作溫度低、滅菌時間短、無殘留毒性,能廣泛應(yīng)用于多種材料和物品的滅菌[1-2]。目前,低溫等離子體破壞細(xì)菌和真菌等微生物的機(jī)制一般認(rèn)為是低溫等離子體中的帶電粒子和活性氧在滅菌過程中起主要作用,帶電粒子可擊穿細(xì)菌等微生物外部結(jié)構(gòu)(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜),而活性氧組分(單原子氧、臭氧、中性亞穩(wěn)態(tài)氧分子、氫氧自由基等)可與細(xì)菌等微生物外部結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大分子反應(yīng),產(chǎn)生刻蝕作用,破壞外部結(jié)構(gòu),導(dǎo)致微生物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的漏出,從而引起微生物死亡[3-5]。有研究表明,低溫等離子體對細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌芽孢、毒素等都具有良好的殺滅效果[6-8]。其中,介質(zhì)阻擋放電(Dielectric barrier discharge,DBD)低溫等離子體因放電面積較大、電子密度高、設(shè)備簡單、適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用,已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[9-10]。

金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)作為一種超抗原,是葡萄球菌分泌的主要外毒素,也是葡萄球菌引起的主要致炎性物質(zhì)[11]。SEB分子量為28.4 kDa,包含有239個氨基酸片段,等電點(diǎn)為8.6,其結(jié)構(gòu)主要由通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接的2個區(qū)域構(gòu)成,具有耐高溫、酸堿和蛋白水解酶等特點(diǎn),產(chǎn)毒量最大(500 μg/mL)[12-13]。一般情況下,人體食入0.004 μg/kg劑量就會受到嘔吐中樞的刺激而引發(fā)嘔吐、腹痛、腹瀉等臨床癥狀,而0.02 μg/kg劑量就足以致死[14],因此對SEB進(jìn)行處理具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來,國內(nèi)外降解腸毒素的研究主要集中在酶降解或微生物降解上。Fujikaw等[15]采用從原料乳中分離的銅綠假單胞菌降解葡萄球菌腸毒素A(SEA),結(jié)果發(fā)現(xiàn)生乳中銅綠假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶對SEA有降解作用。吳擁軍等[16]證明了耐氧雙歧桿菌對大腸桿菌腸毒素具有生物降解作用,它可以把腸毒素(一種小分子的小肽)作為生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)使其分解。然而,關(guān)于物理降解腸毒素的方法鮮有報道,尤其是采用低溫等離子體物理降解SEB的研究尚未見報道。因此,本研究在大氣壓下以空氣為工作氣體,以DBD方式產(chǎn)生低溫等離子體,用低溫等離子體處理SEB后注射給小鼠,通過測定小鼠的存活時間、體重、抗氧化酶活性,評價低溫等離子體對金黃色葡萄球菌腸毒素B的滅活效果及其對小鼠存活時間影響的潛在機(jī)理,為今后低溫等離子體降解SEB的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品 純度100%,用于攻毒時稀釋10倍,美國Sigma公司;SPF級雌性BALB/c小鼠 6～8周齡,體重(20±2) g,50只,北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司提供,動物合格證號為SCXK(京)2018-0001;ELISA試劑盒、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;Tris-HCl、EDTA-2Na 北京Solarbio公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖、氯化鈉 均為國產(chǎn)分析純。

介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院自制;Tektronix TDS2002型示波器、Tektronix P6015a型高壓探頭(1/1000) 上海順測電子有限公司;24 mm×50 mm蓋玻片 上海睿安生物科技有限公司;LGR16-W型臺式高速冷凍離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;(ACCULAB)ALC-2100.2型電子天平 深圳市朗普電子科技有限公司;BCD-288WSL型卡薩帝冰箱 青島海爾股份有限公司;DW-86L578J型超低溫冰箱 廣州科曉科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 低溫等離子體的產(chǎn)生 采用的實(shí)驗裝置,如圖1所示。系統(tǒng)主要由高壓電源、放電電極和阻擋介質(zhì)等組成。高壓電源的中心頻率為50 kHz,輸出的峰值電壓為3 kV;采用厚度為5 mm,直徑(Φ)為5 cm錫箔平板做電極;阻擋介質(zhì)是厚度為1.5 mm,直徑(Φ)9 cm的石英玻璃;電極間氣隙5～10 mm,實(shí)驗中放電間距取8 mm。介質(zhì)阻擋放電過程中的放電電壓、放電頻率的測量通過示波器和高壓探頭進(jìn)行同步顯示波形和測量值。電極裝置置于超凈工作臺內(nèi),電源裝置置于超凈工作臺外。

圖1 介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體滅活SEB裝置圖Fig.1 Diagram of SEB device inactivated bydielectric barrier discharge low-temperature plasma

1.2.2 低溫等離子體處理SEB 稱取100 μg SEB溶于5 mL 0.05 mol/L PBS溶液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖溶液,pH=7.0)中,即SEB的質(zhì)量濃度為20 μg/mL。用移液槍分別將50 μL的SEB溶液滴于規(guī)格為24 mm×50 mm的4片蓋玻片上。1片作為模型組不處理,3片作為處理組置于低溫等離子體發(fā)生裝置中分別處理10、20和30 min。處理完之后,分別立即用950 μL的PBS溶液將SEB溶液沖入試管中?？瞻讓φ战M為PBS溶液。試驗在常壓下的空氣中進(jìn)行,環(huán)境條件為室溫20 ℃,相對濕度60%,每次處理均重復(fù)三次。

1.2.3 SEB含量的測定 將ELISA試劑盒中所有試劑的溫度恢復(fù)至室溫,然后按照試劑盒的說明書在室溫下進(jìn)行操作,測定低溫等離子體處理SEB后的濃度。

1.2.4 SEB休克小鼠模型的建立及其生存時間、體重的測定 將50只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只。一組作為空白對照組,每只腹腔注射1 mL PBS溶液;一組作為陽性組,每只腹腔注射未處理的SEB溶液1 mL(濃度為1 μg/mL);另外3組每組每只分別腹腔注射經(jīng)低溫等離子體處理10、20、30 min后的SEB溶液1 mL。注射后觀察各組小鼠存活情況,記錄存活時間(總觀察時間120 h);并在24 h對每只小鼠進(jìn)行稱重。

1.2.5 10%組織勻漿的制備 在120 h觀察期內(nèi),如果小鼠死亡,則立即取小鼠肝臟于-80 ℃冰箱保存;如果小鼠未死亡,則觀察期結(jié)束后立即處死小鼠,取其肝臟;然后在同一時間下制備組織勻漿液,整個操作在4 ℃條件下進(jìn)行。首先,在冷室4 ℃下取小鼠肝臟組織塊于冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱0.2 g放入10 mL的小燒杯內(nèi);然后用移液器移取1.2 mL的勻漿介質(zhì)(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCl,0.0001 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(冰水浴中操作);再將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,用0.6 mL勻漿介質(zhì)沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,倒入勻漿管中進(jìn)行充分勻漿6～8 min。將制備好的10%勻漿用4 ℃冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10～15 min,取上清置于4 ℃冰箱保存。

1.2.6 小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的測定 以1.2.5制備的勻漿上清液為樣品,按照試劑盒操作測定小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-PX的活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SEB含量測定

由表1可知,與陽性組相比,低溫等離子體處理SEB后,各組SEB含量顯著降低(P<0.05),處理30 min時SEB含量降解率最大,為96%。這表明等離子體對SEB具有破壞作用,破壞效果具有時間依賴性。

表1 等離子體處理前后SEB含量Table 1 The SEB content before and after plasma

2.2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響

在實(shí)驗過程中,空白對照組小鼠在觀察時間內(nèi)無一例死亡,陽性組小鼠(即等離子體處理時間為0 min)腹腔注射SEB后,身體發(fā)抖,口唇發(fā)紫,活動開始減少,24 h的死亡率為100%。低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響見圖2。與陽性組相比,3個處理組小鼠平均生存時間顯著延長(P<0.05),且等離子體處理時間越長,其平均生存時間越久,分別為陽性組的2.50倍、3.33倍、5.00倍,其原因可能是等離子體產(chǎn)生的活性成分,如活性氧、·OH,能夠?qū)Υ蠓肿游镔|(zhì)蛋白質(zhì)、酶、核酸等產(chǎn)生氧化損傷和破壞[17-18],它們通過奪取SEB蛋白上氫原子,使其變性,從而降低了其含量,減少了SEB毒害作用,間接延長了小鼠的存活時間。實(shí)驗還發(fā)現(xiàn),處理SEB 30 min時小鼠的平均存活時間為120 h,與空白對照組相同,這表明該組小鼠體內(nèi)SEB含量與空白對照組相近,該結(jié)論與2.1中結(jié)果相符。

圖2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響(n=10)Fig.2 Effects of SEB that treated with low-temperature plasmaat different times on mice survival time(n=10)注：不同字母表示數(shù)值之間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠體重的影響

小鼠體重的變化也可反映SEB的活性,從而間接反映低溫等離子體對SEB的破壞效果。由表2可知,陽性組與空白對照組相比,小鼠平均體重極顯著下降(P<0.01),并且其平均體重與開始實(shí)驗時(20±2) g相接近,這表明SEB對小鼠生長有毒害作用,抑制其體重增加。與陽性組相比,處理SEB 10、20 min組小鼠平均體重均增加,但差異不顯著(P>0.05),處理SEB 30 min組小鼠平均體重顯著增加(P<0.05),這進(jìn)一步表明等離子體處理對SEB有一定破壞作用,從而降低了處理組SEB對小鼠體重增加的抑制。

表2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠體重的影響Table 2 Effects of SEB that treated with low-temperatureplasma at different times on mice body

2.4 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性構(gòu)成一級抗氧化防御系統(tǒng),在生物系統(tǒng)的總防御機(jī)制和防御策略中起著關(guān)鍵和基礎(chǔ)的作用[19]。由表3可以看出,與空白對照組相比,陽性組CAT、GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05),SOD活性極顯著降低(P<0.01)。與陽性組相比,處理SEB 10 min組對CAT、SOD、GSH-Px活性均無顯著影響(P>0.05);處理SEB 20 min組對CAT、GSH-Px活性均無顯著影響(P>0.05),SOD活性顯著提高(P<0.05);處理SEB 30 min組CAT、GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),SOD活性極顯著提高(P<0.01)。由此可知,低溫等離子體處理SEB對直接注射SEB引起的機(jī)體中SOD、CAT、GSH-PX活性的降低具有緩釋作用,且具有時間依賴性。在等離子體處理SEB 3.0 min時小鼠體內(nèi)CAT、SOD、GSH-Px活性均達(dá)到最大值,與陽性組相比分別增加了69.33%、74.93%、47.92%。有研究表明,SOD水平與機(jī)體衰老呈正相關(guān),GSH-Px具有保護(hù)細(xì)胞膜作用[20-21]。本實(shí)驗結(jié)果表明,各處理組CAT、SOD、GSH-Px活性與陽性組相比均有所提高,說明低溫等離子體處理組能夠改善機(jī)體的抗氧化能力,增強(qiáng)免疫力和細(xì)胞穩(wěn)定性,延緩衰老,進(jìn)而延長小鼠的存活時間。這與包曉瑋等[21]通過提高SOD、GSH-Px的活性來延緩小鼠衰老的結(jié)果相似。且等離子體處理SEB后,小鼠平均生存時間的延長可能與其體內(nèi)抗氧化酶活性的提高有關(guān)。

表3 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of low temperature plasma treatment with SEB on antioxidant enzyme activity in mouse

3 結(jié)論

本實(shí)驗將SEB注射小鼠建立小鼠休克模型評價低溫等離子體對SEB的滅活作用。直接注射SEB的模型小鼠出現(xiàn)了陽性組生存時間和平均體重低于空白對照組,小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-Px活性降低,這些變化表明SEB對小鼠機(jī)體產(chǎn)生了毒害作用,造成了體內(nèi)組織的氧化損傷,進(jìn)而縮短了小鼠的存活時間。

通過將低溫等離子體處理的SEB注射小鼠后,3個處理組小鼠的平均生存時間和平均體重與陽性組相比均有所提高,且小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-Px活性也高于陽性組,在處理SEB 30 min時效果最顯著。以上結(jié)果綜合表明,低溫等離子體處理可以降低SEB的含量,且隨著處理時間的延長,對SEB的降解率越大,從而提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性,增強(qiáng)機(jī)體免疫力和細(xì)胞的穩(wěn)定性,延緩衰老,進(jìn)而延長小鼠的存活時間,且其存活時間具有處理時間依賴性。但是,到目前為止低溫等離子體破壞腸毒素B的機(jī)制尚不清楚,仍需深入探討。