曾瑤英,邵曉露,成淑君,余 倩

(仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東廣州 510225)

果蔬植物病害嚴重影響果實產量與品質,限制農業(yè)更好發(fā)展。但化學農藥對果蔬植物進行防治時,往往造成環(huán)境污染,病害蟲產生抗性,同時帶來農藥殘留等問題。植物源農藥源于植物提取物,具有污染小、毒性小、病蟲不易產生抗性、防治效率高等優(yōu)點,已成為現(xiàn)今研究的熱門[1-3]。植物源農藥是指按一定的方法從植物中提取出殺菌物質及其次生代謝產物加工而成的中藥制劑,含有的抑菌成分復雜,且不同抑菌成分之間會產生協(xié)同增效作用[1]。靚果安作為一種新型的植物源農藥,是由黃連、金銀花、黃芩、黃柏等二十多種中藥材提取而制得,里面還有硫、鈣和鋅等礦物質,具有價格低廉、毒副作用小、易分解和不易產生耐藥性等優(yōu)點。鄒秀華等[4]研究表明,靚果安對核桃潰瘍病、桃樹流膠病以及蘋果果實輪紋病都有很好的防治效果并強壯樹體。張萍等[5]研究表明,2.6%的單一或混用靚果安可防治40%～63%的香梨腐爛病。但迄今為止,關于靚果安在實驗室條件下的抑菌效果以及抑菌機理的研究還未有報道。由于單一生物農藥的抗菌性較差,通過復配農藥助劑不僅能有效利用現(xiàn)有資源,更能減少投入成本,提高產品性能,增大抑菌譜。農藥助劑在病蟲害防治過程中發(fā)揮著重要作用,每種農藥助劑都有特定的功能,如稀釋原液,防止粒滴凝聚變大,增加粒子滲透性、潤濕性或粘黏性,預防施藥不安全等[6]。

大蒜油是由大蒜壓榨而得到的一種油狀物,研究發(fā)現(xiàn)大蒜油具有強抗菌能力,是一種廣譜性抗菌物[7]。大蒜油抗菌原理研究十分透徹,大蒜油中的硫醚化合物、大蒜辣素(C6H10OS2)、大蒜新素(C6H10S3)、α-水芹和醛類化合物等成分對大多數(shù)細菌具有抑制作用。大蒜油抑菌原理主要是活性成分中含有的硫醚基(S-O-S),在硫醚基(S-O-S)進入細胞后,細胞中的巰基被氧化成二硫鍵,影響細胞正常的生理代謝,抑制細胞繼續(xù)分裂進而起到殺菌的作用[8-9]。

本文選取安全低毒的生物農藥靚果安復配農藥助劑大蒜油作為殺菌劑,通過試驗選出最佳復配組合,降低農藥使用量;與此同時進行光鏡下菌體形態(tài)的觀察和投射電鏡下細胞微結構的觀察來探究抑菌劑的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靚果安、大蒜油 濰坊奧豐作物病毒防治有限公司;PBS緩沖液 北京雷根生物技術有限公司;草酸銨結晶紫染色液、革蘭氏碘液、95%乙醇、復紅染液 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌菌種來源ATCC6538、大腸桿菌菌種來源ATCC6538 上海魯微科技有限公司。

ACQUITY UPLC型液相色譜儀 美國 Waters公司;Triple-TOFTM5600+型質譜儀 美國AB SCIEX公司;生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司;紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;投射電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 活化菌種及制備菌懸液 在超凈工作臺上將2株供試菌種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h。

利用麥氏比濁法配制麥氏比濁管,分光光度計法測量不同比濁管的吸光度[10-13],制備好的麥氏比濁管,用紫外分光光度計(波長600 nm)測量不同比濁管的吸光度值,得出標準曲線y=0.0812x+0.164(R2=0.9943),比濁管的濁度與OD值、比濁管的濁度與菌懸液的濁度呈線性關系,而菌懸液的濁度與細菌菌落數(shù)呈正相關,因此菌懸液的細菌菌落數(shù)可利用分光光度計測定菌懸液的吸光值計算得知。

挑取少量細菌菌落于無菌生理鹽水中,振蕩5 min,利用分光光度計測量其吸光值,通過標準曲線用生理鹽水調整其濃度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,再稀釋菌懸液濃度至106～107CFU/mL。

1.2.2 抑菌圈的測定方法 參考陳度煌[14]的方法,在此方法上進行改良。將適量營養(yǎng)瓊脂倒入平板,凝固后,取100 μL菌懸液,用涂布棒涂布均勻后,將牛津杯平穩(wěn)放置已涂布菌懸液的平皿上,加入200 μL抑菌劑,蓋好平皿蓋,置于37 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。

1.2.3 最低抑菌濃度的測定 體外培養(yǎng)細菌18～24 h,抑制細菌生長所需藥物的最低濃度稱為最低抑菌濃度[15](Minimum inhibitory concentration,MIC),是測量抑菌試劑的抑菌作用大小的指標。

1.2.3.1 靚果安抑菌劑MIC的測定 以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為待測菌株,無菌水為空白對照,靚果安用無菌水稀釋成濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 mg/mL的抑菌液,取1 mL于裝有9 mL牛肉膏蛋白胨的錐形瓶中,搖勻后,趁熱倒平板,待平板冷卻凝固后,吸取濃度106～107CFU/mL的各菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均勻涂抹,倒置放于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以培養(yǎng)皿中不長菌時抑菌劑的濃度確定為最低抑菌濃度,即MIC。

1.2.3.2 大蒜油抑菌劑MIC的測定 方法同1.2.3.1,大蒜油對金黃色葡萄球菌MIC測定:大蒜油用無菌水稀釋成濃度為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0 mg/mL;大蒜油對大腸桿菌MIC測定:大蒜油用無菌水稀釋成濃度為51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0 mg/mL。

1.2.3.3 復配液部分抑菌濃度指數(shù) 部分抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)為抗菌藥藥效學參數(shù)之一,是兩種抗菌藥的聯(lián)合藥敏指標[16]。本實驗旨在判斷兩種抑菌劑復配使用后是否達到協(xié)同作用。

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為待測菌株,利用棋盤法[17],分別將0.5 mL濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的靚果安稀釋液和0.5 mL濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的大蒜油稀釋液進行復配,得到1 mL復配液,將復配液加入含有9 mL牛肉膏蛋白胨的錐形瓶中,使其最終各組分濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125 MIC,均勻搖動,趁熱倒平板,待平板冷卻凝固后,吸取濃度106～107CFU/mL的各菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均勻涂抹,倒置放于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以無肉眼可見菌落的最低抑菌劑稀釋液濃度為復配液對兩株供試菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

觀察實驗結果,得到各個抑菌劑復配使用時的MIC,計算出抑菌劑聯(lián)合的FIC指數(shù),FIC指數(shù)的判斷標準為:FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用,0.52為拮抗作用。

FIC指數(shù)=MICA(聯(lián)合)/MICA(單用)+MICB(聯(lián)合)/MICB(單用)

1.2.4 靚果安與大蒜油以及復配液對菌體生長曲線的影響 取活化到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,調節(jié)菌懸液到106～107CFU/mL。每株菌懸液分別按照與靚果安MIC、大蒜油MIC以及復配液MIC體積比1∶50的比例加入,每種菌的每種處理測定時間24 h,在600 nm下每隔2 h測定OD值,以靚果安MIC、大蒜油MIC以及復配液MIC 空白調零并記錄吸光值[18]。

1.2.5 光學顯微鏡的觀察

1.2.5.1 樣品的前處理 挑取少量對數(shù)期的細菌菌落于無菌生理鹽水中,振蕩幾分鐘,利用分光光度計測量其吸光值,通過標準曲線用生理鹽水調整其濃度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,用移液槍移取1 mL的菌懸液于99 mL的LB肉湯中,得到1.5×106～3.0×106CFU/mL的菌懸液肉湯。將濃度為MIC的三種抑菌劑(靚果安、大蒜油、復配液)分別添加入制備好的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌肉湯菌懸液中,搖勻后在37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 光學顯微鏡觀察 菌體革蘭氏染色后在光學顯微鏡下進行觀察[16],以未經抑菌劑處理的為空白組,進行對比,觀察結構的差異性。

1.2.6 透射電子顯微鏡的觀察

1.2.6.1 樣品的前處理 分別在制備好的濃度為106～107CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液中加入濃度為 MIC 的三種抑菌劑(靚果安、大蒜油、復配液),分別搖勻后在37 ℃培養(yǎng)24 h,離心(2500 r/min,15 min,4 ℃)后去上清液,PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)漂洗三次,菌體于3%的戊二醛固定液中,低溫下固定,備用[19]。

1.2.6.2 透射電子顯微鏡觀察 使用PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)沖洗3次,每次15 min。再用1%鋨酸固定2 h,PBS沖洗3次,經一系列乙醇(體積分數(shù)為30%、50%、70%、90%)逐級脫水,然后用現(xiàn)配的90%丙酮和無水丙酮分別洗脫1～3次,每次15 min。環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂1∶1混合后作為浸透劑浸透樣品1 h后用純環(huán)氧樹脂包埋,于 37、45 ℃下分別聚合 24 h,最后入 60 ℃溫箱過夜。待樣品塊凝固后修塊,經鈾、鉛雙染后,JEM-1230型投射電鏡下觀察、拍照,每個樣本重復取兩個平行進行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全文的圖用Origin 8制作,數(shù)據(jù)采用SPSS 19進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 最低抑菌濃度的測定

2.1.1 靚果安抑菌劑MIC的測定 由表1可知,對比實驗組與空白組,空白組生長菌落總數(shù)增多,可知靚果安對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用;金黃色葡萄球菌從20 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為0,可知靚果安對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為20 mg/mL;大腸桿菌在40 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為0,可知靚果安對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為40 mg/mL。

表1 靚果安對實驗菌株最低抑菌濃度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration of Liangguoan to the test strains

表5 復配液對大腸桿菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of compound solution on Escherichia coli

2.1.2 大蒜油抑菌劑MIC的測定 由表2可知,對比實驗組與空白組,空白組生長菌落總數(shù)明顯較多,可知大蒜油對金黃色葡萄球菌具有抑制作用;從0.4 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為零,可知大蒜油對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.4 mg/mL。

表2 大蒜油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 2 Minimum inhibitory concentration of garlic oil against Staphylococcus aureus

由表3可知,對比實驗組與空白組,空白組生長菌落總數(shù)明顯增多,可知大蒜油對大腸桿菌具有抑制作用。從51.2 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為零,大蒜油對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為51.2 mg/mL。

表3 大蒜油對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 3 Minimum inhibitory concentration of garlic oil on Escherichia coli

實驗室環(huán)境下靚果安對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果相當,大蒜油對金黃色葡萄球菌的抑制能力較強,對大腸桿菌的抑制效果較差。

2.1.3 復配液部分抑菌濃度指數(shù)

2.1.3.1 復配液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果 由表4可知,靚果安和大蒜油聯(lián)合使用后,對金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強。靚果安與大蒜油復配之后對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為:MICA(聯(lián)合)為0.3125 mg/mL,MICB(聯(lián)合)為0.00625 mg/mL,可得FIC(金黃色葡萄球菌)為0.03125,表現(xiàn)出協(xié)同作用。復配時靚果安和大蒜油的質量比為0.3125∶0.00625,,即50∶1,所以本次實驗采用靚果安和大蒜油的比例為50∶1作為最佳配比。

表4 復配液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of compound solution on Staphylococcus aureus

2.1.3.2 復配液對大腸桿菌的抑菌效果 由表5可知,靚果安和大蒜油聯(lián)合使用后,對大腸桿菌的抑菌效果增強。靚果安與大蒜油復配之后對大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為:MICA(聯(lián)合)為10 mg/mL,MICB(聯(lián)合)為3.2 mg/mL,計算可得FIC(大腸桿菌)為0.3125,表現(xiàn)出協(xié)同作用。復配時靚果安和大蒜油的質量比為10∶3.2,約為3∶1,所以本次實驗采用靚果安和大蒜油的比例為3∶1作為最佳配比。

2.2 靚果安與大蒜油以及復配液對菌體生長曲線的影響

圖1為靚果安與大蒜油以及復配液對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。由圖1所示,隨著時間的增加,實驗組與空白組OD值均呈現(xiàn)上升的趨勢。在0～8 h中,上升趨勢快速,其中金黃色葡萄球菌空白處理組上升幅度最大,結果表明,三種不同配方的抑菌劑對金黃色葡萄球菌生長具有抑制作用。8～18 h中,菌體數(shù)量隨著時間的增加而增加,產生一定的競爭機制,導致菌體數(shù)量上升不幅度減小,故此,菌體OD值上升幅度緩慢的下降,在18～24 h中,菌體數(shù)量趨于平穩(wěn),在有限的培養(yǎng)條件下,菌體生長競爭越來越激烈,數(shù)量就會慢慢趨于穩(wěn)定。

圖1 金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Staphylococcus aureus

復配液處理組比靚果安單獨使用的抑菌效果好,大蒜油單獨使用比復配抑菌劑的抑菌效果略好一點,藥效相差區(qū)別不大,靚果安復配大蒜油中的大蒜油的用量卻比大蒜油單獨使用的量減少了很多,有明顯的農藥減量化,表明靚果安復配大蒜油這種抑菌劑具有很好的實用價值。

如圖2隨著時間增加,大腸桿菌菌體數(shù)量也在增加。這與金黃色葡萄球菌的生長的趨勢相似的,整體都是一開始幅度增加比較大然后幅度變小,到最后趨于平緩,產生這一現(xiàn)象的原因與金黃色葡萄球菌也是相似的。并且大腸桿菌空白組的菌體數(shù)量始終都比其他三個處理的菌體數(shù)量多,表明這些抑菌劑對大腸桿菌有抑制作用,靚果安復配大蒜油的抑菌能力比單獨使用靚果安或者單獨使用大蒜油好。

圖2 大腸桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of E. coli

2.3 光學顯微鏡觀察

將每組處理的菌體采用革蘭氏染色在光學顯微鏡里進行觀察菌體形態(tài)。如圖3所示,金黃色葡萄球菌空白組中的菌體成串連接并且連接緊密,菌體呈圓形或者橢圓形,實驗處理組菌體分散,不成串連接,菌體體積明顯小于空白組,且形狀發(fā)生改變,不是完整的圓形或橢圓形,在菌體周圍有細小的殘體,其中復配抑菌劑組菌體更為散亂,體積更小。

圖3 光學顯微鏡下金黃色葡萄球菌細胞形態(tài)結構(×1000)Fig.3 Cell morphology of Staphylococcus aureusunder light microscopy(×1000)注:a:空白對照;b:靚果安;c:大蒜油;d:復配液;圖4同。

如圖4所示,大腸桿菌空白組中的菌體呈長桿狀,形狀完整,實驗處理組的菌體明顯變短,體積變小,且更為散亂,在菌體周圍形成細小的殘體。

圖4 光學顯微鏡下大腸桿菌細胞形態(tài)結構(×1000)Fig.4 Morphological structure of E. colicells under light microscope(×1000)

2.4 透射電子顯微鏡的觀察

將每組處理好的菌體放置于JEM-1230型TEM下觀察、拍照,每個樣本重復取兩個平行進行觀察,見圖5。

圖5 透射電子顯微鏡下金黃色葡萄球菌的形態(tài)結構Fig.5 Morphological structure of Staphylococcus aureusunder transmission electron microscope注:a:空白對照,×50000;b:靚果安,×20000;c:大蒜油,×20000;d:復配液,×20000;圖6同。

如圖5a所示,正常的金黃色葡萄球菌細胞膜完整,呈現(xiàn)圓形,形態(tài)飽滿,細胞之間的間隙清晰,沒有出現(xiàn)細胞破裂和內容物外泄現(xiàn)象,細胞正常生長分裂。如圖5b所示,靚果安作用下的金黃色葡萄球菌體積較空白組有所變小,小部分細胞的細胞膜發(fā)生破裂,內容物流出,總體上形態(tài)仍是圓形。如圖5c所示,大蒜油作用下的金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)發(fā)生異常,菌體欠飽滿,細胞表面出現(xiàn)破損,內容物外泄,部分細胞膜質分離嚴重。如圖5d所示,靚果安和大蒜油復配作用下的金黃色葡萄球菌菌體細胞膜破裂嚴重,大量細胞原生質外泄,細胞與細胞之間的界限變得模糊,在細胞體周圍可見許多殘體。由此可見,抑菌強度為:復配液>大蒜油>靚果安,即復配組對金黃色葡萄球菌的破壞作用相比于單用靚果安或大蒜油更強烈,這為靚果安和大蒜油協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌提供了有益依據(jù)。

如圖6a所示,正常的大腸桿菌形態(tài)完好,細胞壁和細胞膜光滑平整且緊密相連,細胞質均勻,呈現(xiàn)典型的短桿狀,菌體飽滿。如圖6b所示,靚果安作用下的大腸桿菌菌體表面粗糙,內容物外泄,部分菌體質壁分離現(xiàn)象嚴重,細胞質出現(xiàn)空洞,形態(tài)變得狹長或出現(xiàn)斷裂,但整體上仍呈現(xiàn)桿狀。如圖6c所示,大蒜油作用下的大腸桿菌形態(tài)嚴重扭曲變形,菌體細胞大量碎裂,已失去大腸桿菌短桿狀的特征。如圖6d所示,靚果安和大蒜油復配作用下的大腸桿菌菌體已被嚴重破壞,無可見的完整細胞壁細胞膜,變成了大量碎片。由此可見,抑菌強度為:復配液>大蒜油>靚果安,即復配組對大腸桿菌的破壞作用相比于單用靚果安或大蒜油更強烈,這為靚果安和大蒜油協(xié)同抑制大腸桿菌提供了有益依據(jù)。

圖6 透射電子顯微鏡下大腸桿菌的形態(tài)結構Fig.6 Morphological structure of Escherichia coliunder transmission electron microscope

3 結論與討論

靚果安和大蒜油對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)都具有一定的抑制效果。靚果安和大蒜油的復配對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同作用,最佳配比為50∶1;靚果安和大蒜油的復配對大腸桿菌表現(xiàn)出相加作用,最佳配比為3∶1。經復配劑處理的金黃色葡萄菌和大腸桿菌的生長曲線均出現(xiàn)變化,表現(xiàn)為生長緩慢。光學顯微鏡分析表明,靚果安和大蒜油處理后的菌體分散,其中復配抑菌劑的菌體更為散亂,實驗組的菌體形狀均發(fā)生改變,外形縮小,細胞裂解。透射電鏡分析表明,實驗組的菌體發(fā)生嚴重異變,細胞脫落溶解,其抑菌機理可能在于破壞菌體的細胞壁和細胞膜,致使細胞死亡[20-23]。