姜聲旺,沈清武

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

動(dòng)物屠宰后,肌肉細(xì)胞以糖酵解的方式供能。糖酵解產(chǎn)生的乳酸和熱量導(dǎo)致pH下降,軀體溫度升高。高溫和低pH使蛋白質(zhì)變性,肌肉收縮,水分從細(xì)胞滲出,從而產(chǎn)生PSE(Pale,Soft,Exudative)肉,降低肉品質(zhì)[1-3]。PSE的高發(fā)生率給屠宰業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。由此可見(jiàn),減緩宰后糖酵解速度可有效控制PSE肉的發(fā)生,提高肉品質(zhì)。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解的限速酶之一,催化糖酵解的最后一步反應(yīng),將磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷,生成丙酮酸和三磷酸腺苷[7-8]。有研究表明,PSE肌肉中的丙酮酸激酶可能發(fā)生了磷酸化或者乙?；揎?從而使得該肌肉中的丙酮酸激酶活性比正常肉中的要高,但具體機(jī)制尚不清楚[9-12]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)有4種PK同工酶:PKL、PKR、PKM1和PKM2,PKL和PKR是由PKLR基因編碼的不同剪接體;PKM1和PKM2是由PKM基因編碼的不同剪接體[13-15]。這四種剪接體的表達(dá)具有組織特異性,其中PKL主要在肝臟和腎臟中表達(dá);PKR主要在紅細(xì)胞中表達(dá);PKM1主要在正常成年期尤其是肌肉組織中表達(dá);而PKM2主要在胚胎發(fā)育期和腫瘤組織中表達(dá)[13-15]。小鼠PKM1和PKM2的差異在于PKM1含有外顯子9而不含外顯子10;PKM2含有外顯子10而不含外顯子9,二者之間共有22個(gè)氨基酸的差異[13-15]。慢病毒載體是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的,能把外源基因有效地整合到宿主染色體中并持久表達(dá)目的基因,具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、外源基因表達(dá)量高、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[16-18]?！癎olden Gate”克隆法是在同一反應(yīng)體系中,利用ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶,在識(shí)別位點(diǎn)后面切開DNA,產(chǎn)生帶有粘性末端的DNA片段,同時(shí)用連接酶將幾個(gè)DNA片段按照特定的順序連接成無(wú)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA片段,具有省時(shí)省力且不含酶切位點(diǎn)片段的優(yōu)點(diǎn)[19-20]。C2C12細(xì)胞是由Yaffe等[21]建立的小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆,在低血清條件下C2C12細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成肌管,并表達(dá)myosin和myogenin等特征性蛋白。因此,C2C12細(xì)胞是研究成肌細(xì)胞增殖和分化的首選模型[22-25]。

本研究用“Golden Gate”克隆法構(gòu)建了小鼠PKM1基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PKM1基因的C2C12細(xì)胞株,為深入研究PKM1翻譯后修飾對(duì)其自身酶活及細(xì)胞糖酵解的影響提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胚胎腎上皮細(xì)胞293T、小鼠成肌細(xì)胞C2C12賽齊(上海)生物工程有限公司;pGEM-T載體系統(tǒng)(含JM109感受態(tài)細(xì)胞) 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI骨架載體、pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架載體、病毒包裝質(zhì)粒Mix(pMDLG/pRRE、pCMV-VSVG、pRSV-Rev) 賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司;Stbl3感受態(tài)細(xì)胞 廣州復(fù)能基因有限公司;動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒、溴化乙錠(EB)溶液、6×DNA上樣緩沖液、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;1.1×Super PCR Mix、DL2000 DNA Marker 北京擎科生物技術(shù)有限公司;Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液、BsaI-HFv2(含10×CutSmart Buffer)、ATP NEB(北京)有限公司;平末端DNA加A試劑盒 北京博凌科為生物科技有限公司;Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(含蛋白酶K)、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent、HBSS 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、1×PBS、胰蛋白酶(0.25% Trypsin & 0.02% EDTA) Biological Industries公司;聚凝胺、嘌呤霉素 上海翊圣生物科技有限公司;SYBR Premix ExTaq II、Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser 寶生物工程(大連)有限公司;乳酸含量檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒(葡萄糖氧化酶法) 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;IX53型倒置顯微鏡 OLYMPUS公司;HF240型CO2培養(yǎng)箱、NeoFuge 1600R型離心機(jī) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳槽、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-2C型電泳儀電源 北京六一儀器廠;ES-60型恒溫孵育搖床 杭州米歐儀器有限公司;Veriti 96-well Thermal Cycler PCR儀 Life Technologies公司;Image Quant LAS 4000 mini型發(fā)光圖像分析儀 美國(guó)通用電氣公司;GBox F3型凝膠成像系統(tǒng) Syngene 公司;Rotor-Gene Q型2通道熒光定量PCR儀 QIAGEN公司;FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Golden Gate法構(gòu)建表達(dá)載體

1.2.1.1 總RNA提取 取小鼠背最長(zhǎng)肌,用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和A260/A280比值檢測(cè)RNA完整性和純度。

1.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 以總RNA為模板,用TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上公布的小鼠PKM1的cDNA序列(NM_001253883.1)設(shè)計(jì)引物。正向引物:5′ATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′TCAAGGTACAGGCACTACACGCATG3′。含起始密碼子和終止密碼子。

1.2.1.4 目的片段的擴(kuò)增回收 以cDNA 第一鏈為模板,加入上述引物(1.2.1.3)以及Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液,PCR擴(kuò)增目的基因(PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液說(shuō)明書操作)。擴(kuò)增出的序列為小鼠PKM1的完整雙鏈cDNA,全長(zhǎng)1596 bp。PCR產(chǎn)物用含EB染料的1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下根據(jù)DNA Marker確定目的片段位置并切膠用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.5 目的片段與T載體連接 用高保真酶擴(kuò)增出的DNA片段是平末端,無(wú)法直接與T載體連接。因此,先用平末端DNA加A試劑盒在目的片段3′末端加上一個(gè)A堿基,然后再與線性化pGEM-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞(連接和轉(zhuǎn)化步驟按T載體說(shuō)明書進(jìn)行)并加入SOC培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后,吸取部分菌液涂布到含氨芐青霉素的LB平板中,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定正確的菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pGEM-T-mPKM1,并測(cè)序鑒定目的片段序列是否正確。

1.2.1.6 加酶切位點(diǎn) 以測(cè)序正確的質(zhì)粒pGEM-T-mPKM1為模板,設(shè)計(jì)帶有BsaI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的引物,進(jìn)行PCR。正向引物:5′ atcgGGTCTCG CAAGATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′atcgGGTCTCGGGGTTCAAGGTACAGGCACTACA CGCATG3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。

1.2.1.7 入門載體的構(gòu)建 以骨架載體pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI和PCR產(chǎn)物(1.2.1.6)進(jìn)行Golden Gate反應(yīng),構(gòu)建入門載體pDown-3×FLAG/mPKM1。反應(yīng)體系:0.75 μL BsaI-HFv2,1 μL 10×CutSmart Buffer,1 μL 10 mmol/L ATP,0.25 μL T7 DNA 連接酶,1 μL 20 ng/μL PCR產(chǎn)物,1 μL 100 ng/μL骨架載體,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序:37 ℃ 5 min,20 ℃ 5 min,共15個(gè)循環(huán),然后80 ℃滅活20 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)胞,涂布到含卡那霉素的LB平板中,培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定正確的克隆菌落搖菌培養(yǎng)后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,并送質(zhì)粒測(cè)序鑒定目的基因序列是否正確,測(cè)序引物4條(表1)。

表1 測(cè)序引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of primer used for sequencing

1.2.1.8 表達(dá)載體構(gòu)建 將測(cè)序正確的質(zhì)粒(1.2.1.7)進(jìn)行Gateway反應(yīng)。13 ng啟動(dòng)子入門克隆 pUp-EF1A,13 ng入門載體pDown-3×FLAG/mPKM1,60 ng pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架載體,1 μL Gateway LR Clonase II Enzyme Mix,TE buffer 補(bǔ)足至5 μL。25 ℃反應(yīng)3 h后加入蛋白酶K終止反應(yīng)10 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)胞,涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR,篩選陽(yáng)性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,酶切鑒定載體。鑒定正確的載體即為最終的表達(dá)載體pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>3xFLAG/mPKM1。

1.2.2 慢病毒包裝

1.2.2.1 293T細(xì)胞培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染前1 d,接種293T細(xì)胞到10 cm培養(yǎng)皿中,以轉(zhuǎn)染當(dāng)天的細(xì)胞達(dá)到90%匯合度為宜,轉(zhuǎn)染前1 h時(shí)更換10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10% FBS)。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 取1.5 mL滅菌EP管加入500 μL無(wú)血清DMEM,2 μg包裝質(zhì)粒Mix和2 μg表達(dá)載體質(zhì)粒,混勻后靜置5 min。另取一個(gè)1.5 mL滅菌EP管加入500 μL無(wú)血清DMEM以及8 μL轉(zhuǎn)染試劑充分混勻后靜置5 min。將兩個(gè)EP管中的混合物合在一起混勻,靜置20 min后逐滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,輕輕混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染5 h后,更換10 mL完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.3 慢病毒收集濃縮 分別在48、72 h時(shí),收集富含慢病毒顆粒的培養(yǎng)基到15 mL離心管中,500×g離心5 min去除細(xì)胞沉淀,回收上清,用0.45 μm的濾器過(guò)濾,收集濾液,50000×g高速離心2 h,棄上清。用適量HBSS充分溶解病毒沉淀,即為濃縮慢病毒。

1.2.2.4 qPCR法測(cè)定慢病毒滴度 制作qPCR標(biāo)準(zhǔn)品:將細(xì)胞內(nèi)已知拷貝數(shù)的ALB基因克隆到載體并提取質(zhì)粒,作為標(biāo)準(zhǔn)品1。標(biāo)準(zhǔn)品2為慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(含WPRE基因)。轉(zhuǎn)導(dǎo)前1 d,接種293T細(xì)胞到6孔板中,轉(zhuǎn)導(dǎo)前,消化一個(gè)孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),獲取靶細(xì)胞數(shù)(A);病毒稀釋一定倍數(shù)(B),轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞(V,mL),加入聚凝胺促進(jìn)感染。48 h后,收集細(xì)胞并提取基因組DNA。

qPCR:用兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別獲取DNA樣品的ALB拷貝數(shù)和WPRE拷貝數(shù),計(jì)算出平均每個(gè)樣品中病毒序列的拷貝數(shù)C,進(jìn)而根據(jù)以下公式計(jì)算出慢病毒滴度。

病毒滴度(TU/mL)=A×B×C/V

1.2.3 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最佳MOI值的確定 將C2C12細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后按3×105cells/孔 接種至6孔板內(nèi),加入2 mL完全培養(yǎng)基后置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將慢病毒配成感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為10、20、30、40、50的稀釋液并加入各孔中,繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后,根據(jù)EGFP的表達(dá)情況確定最佳MOI值。

1.2.3.2 最佳抗生素篩選濃度的確定 按1.2.3.1方法接種并培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。設(shè)0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 μg/mL共6個(gè)濃度梯度,每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,每2 d換一次新的含抗生素的培養(yǎng)基,繼續(xù)篩選?？股刈罴押Y選劑量為3～4 d內(nèi)導(dǎo)致全部細(xì)胞死亡的最低濃度。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選

1.2.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 按1.2.3.1方法接種細(xì)胞,加入2 mL完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)胞匯合度在30%～50%時(shí),更換1 mL新鮮完全培養(yǎng)基,用胰酶消化其中一孔細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將慢病毒在4 ℃下融解,輕輕混勻。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果、病毒滴度和MOI計(jì)算病毒加入的量,每孔加入終濃度為5 μg/mL的聚凝胺提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,充分搖勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)(若見(jiàn)細(xì)胞有明顯毒性反應(yīng),可將轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間縮短為6～8 h),并更換2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基。48 h后拍照,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4.3 細(xì)胞純化 按照病毒的篩選基因puro,對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞更換為含最佳濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行藥篩。每2 d更換新鮮的藥篩培養(yǎng)基,繼續(xù)傳代擴(kuò)增。細(xì)胞數(shù)量達(dá)到理想要求后,進(jìn)行凍存及RT-qPCR和WB檢測(cè)。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)量

1.2.5.1 細(xì)胞總RNA提取 提取總RNA并進(jìn)行去DNA處理。

1.2.5.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄 用 Takara Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5.3 熒光定量PCR 以β-actin為內(nèi)參,用 SYBR Green I染料法對(duì)目的基因表達(dá)情況進(jìn)行相對(duì)定量,每個(gè)樣品做三個(gè)平行,相對(duì)定量采用 2-ΔΔCT法。qPCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序按表2、表3進(jìn)行(步驟2 60 ℃復(fù)性延伸時(shí)收集熒光信號(hào)),引物信息見(jiàn)表4。

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

表3 qPCR反應(yīng)程序Table 3 Reaction procedure of qPCR

表4 引物信息Table 4 Primer information

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

1.2.6 Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量

1.2.6.1 誘導(dǎo)細(xì)胞分化 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種C2C12細(xì)胞(野生型、空載體、過(guò)表達(dá))用胰蛋白酶消化后按3×105cells/孔接種到6孔板中。用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到95%后,改用含2%HS的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)成肌分化,每24 h更換一次培養(yǎng)基,第5 d時(shí)肌管形成率最高,收集細(xì)胞提取蛋白,同時(shí)收集培養(yǎng)基測(cè)定pH和乳酸含量。

1.2.6.2 蛋白提取 用PBS漂洗細(xì)胞后加入適量RIPA細(xì)胞裂解液,將細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中(所有操作在冰上進(jìn)行,所有試劑均預(yù)冷)。冰浴超聲波破碎,功率200 W,超聲20 s,間隔10 s,共25次。4 ℃ 12000×g離心10 min后收集上清液備用。

1.2.6.3 SDS-PAGE電泳 根據(jù)PKM1分子量大小(60 kDa)配制8%的分離膠,混勻后加到制膠玻璃板間,用異丙醇?jí)浩揭好?。凝固后倒掉異丙醇并用雙蒸水清洗,用濾紙吸干水分。配制5%濃縮膠,加到分離膠上,插入梳子,凝固后將膠板裝入電泳槽。倒入電泳緩沖液,淹沒(méi)中間室。吸取適量蛋白樣品,與等量2×SDS-PAGE loading buffer混勻,100 ℃金屬浴加熱5 min,取8 μL加于點(diǎn)樣孔中,取1孔加入4 μL蛋白marker以確定目的條帶。75 V電壓電泳,待指示劑跑到底部時(shí)停止。

1.2.6.4 轉(zhuǎn)膜 電泳結(jié)束后,切除多余的膠,剪取PVDF膜并用甲醇浸泡活化10 s,將凝膠、PVDF膜和濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min,按照白板-海綿-3層濾紙-PVDF膜-凝膠-3層濾紙-海綿-黑板的順序放置,250 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜1 h后取出PVDF膜。

1.2.6.5 封閉 PVDF用TBST洗滌液漂洗膜3次,5 min/次,洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入封閉液,室溫振蕩孵育1 h。

1.2.6.6 抗體孵育及顯色成像 封閉結(jié)束后漂洗膜3次。分別用兔抗鼠PKM1一抗和鼠抗FLAG一抗4 ℃孵育過(guò)夜,漂洗膜3次,再分別用羊抗兔二抗和馬抗鼠二抗與對(duì)應(yīng)的膜室溫?fù)u動(dòng)孵育膜1 h。漂洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光成像并用Image J對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量測(cè)定

1.2.7.1 pH測(cè)定 用pH計(jì)直接測(cè)定各組培養(yǎng)基的pH。

1.2.7.2 乳酸含量測(cè)定 用乳酸含量測(cè)定試劑盒按照說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 C2C12細(xì)胞的葡萄糖消耗試驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種C2C12細(xì)胞(野生型、空載體、過(guò)表達(dá))用胰蛋白酶消化,然后用含10% FBS+1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105cells/mL,接種到12孔板中,每孔2 mL(即4×105cells/孔),培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。用PBS洗滌后,更換為無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h,使其同步化。再次吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌后,更換為2 mL含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)空白組(只加含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,不加細(xì)胞)。24 h后吸取各孔培養(yǎng)基,用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中剩余葡萄糖含量,并按以下方法計(jì)算:

葡萄糖含量(mmol/L)=樣本管吸光度/校準(zhǔn)管吸光度×校準(zhǔn)液濃度(5.55 mmol/L)

葡萄糖消耗量則按下式計(jì)算:

ΔGC=GC0-GCx

式中：ΔGC:各組細(xì)胞葡萄糖消耗量,mmol/L;GC0:未接種細(xì)胞的空白組中24 h后的葡萄糖含量,mmol/L;GCx:各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量,mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Image J 1.52a計(jì)算條帶灰度值從而對(duì)蛋白進(jìn)行定量。pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗試驗(yàn)各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)重復(fù)測(cè)量三次。用SPASS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn),并用Prism 8.0.2繪圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA完整性和純度檢測(cè)

提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定出5S、18S和28S三條帶(圖1),A260/A280比值為2.05,說(shuō)明提取的RNA完整性較好,純度較高,可以用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

圖1 小鼠背最長(zhǎng)肌總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Total RNA s of mouse longissimus dorsi 注:1、2:提取的總RNA。

2.2 目的片段擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得小鼠PKM1編碼區(qū)序列,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了與預(yù)期大小(1596 bp)相符的條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序,目的條帶與NCBI公布的小鼠PKM1基因cDNA序列相似性為100%。

圖2 小鼠PKM1基因cDNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of cDNA of mouse PKM1 gene注:Marker:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:目的片段。

2.3 表達(dá)載體的酶切鑒定

用NheⅠ和ApaLⅠ酶切組合對(duì)表達(dá)載體(圖3)進(jìn)行酶切鑒定,預(yù)測(cè)會(huì)產(chǎn)生1246、2521、3287、3985 bp四個(gè)片段。實(shí)際酶切結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致,說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建正確。測(cè)序結(jié)果表明,目的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布序列相似性為100%。

圖3 表達(dá)載體圖譜及其酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Expression vector map and its enzyme digestion results注:Marker:GeneRuler 1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:NheⅠ和ApaLⅠ酶切產(chǎn)生的片段。

2.4 慢病毒滴度測(cè)定

經(jīng)qPCR測(cè)定,濃縮后的慢病毒滴度為3.4×108TU/mL,該滴度可滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.5 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

用熒光顯微鏡放大100倍觀察不同MOI和不同抗生素濃度下的細(xì)胞形態(tài),確定最佳MOI為30,最佳嘌呤霉素篩選濃度為1.2 μg/mL。如圖4所示,A、B和C、D分別為最佳MOI和最佳藥篩濃度下感染48 h后過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組C2C12細(xì)胞的白光圖和熒光圖。由圖4A、圖4C可以看出細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且呈梭狀,符合該細(xì)胞的形態(tài)特征,說(shuō)明慢病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯損傷。從圖4B、圖4D可以看出,感染上慢病毒表達(dá)載體的細(xì)胞由于表達(dá)綠色熒光蛋白而呈現(xiàn)綠色,EGFP熒光率達(dá)80%以上,說(shuō)明,感染成功,感染效率良好。

圖4 最佳轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞狀態(tài)Fig.4 Cell state under the optimal transfection conditions

2.6 qPCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)量

用相對(duì)定量的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化,按照2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)組FLAG-mPKM1的表達(dá)量大約是對(duì)照組的9.4萬(wàn)倍(表5)。

表5 目的基因相對(duì)表達(dá)量Table 5 Relative expression level of target gene

2.7 Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量

用PKM1抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)時(shí),過(guò)表達(dá)組檢測(cè)到兩條目的條帶,分別是內(nèi)源性PKM1條帶和帶有Flag標(biāo)簽的外源PKM1條帶,由于外源性條帶含有3×FLAG標(biāo)簽,因此,蛋白分子量略微大于內(nèi)源性的,而轉(zhuǎn)空載體的細(xì)胞和野生型細(xì)胞只有一條內(nèi)源性的PKM1條帶。用FLAG標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)時(shí),過(guò)表達(dá)組由于含有FLAG標(biāo)簽,因此有一條帶,而空載體組和野生型組由于不含F(xiàn)LAG標(biāo)簽因此沒(méi)有條帶(圖5A)。綜合以上結(jié)果表明,成功篩選到了過(guò)表達(dá)小鼠PKM1基因的C2C12細(xì)胞株且目的蛋白成功在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),且經(jīng)灰度值分析,內(nèi)源性PKM1的表達(dá)量在三組之間無(wú)顯著性差異。

圖5 目的蛋白的Western Blot檢測(cè)(A)及內(nèi)源性PKM1相對(duì)表達(dá)量(B)分析Fig.5 Western Blot results of target protein(A)and relative level(B)of endogenous PKM1注:1:過(guò)表達(dá)組;2:空載體組;3:野生型組。n=3,字母不同代表顯著性差異(P<0.05);圖6～圖8同。

2.8 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量以及葡萄糖消耗量測(cè)定

細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生乳酸并釋放到培養(yǎng)基中,乳酸積累導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降。因此,測(cè)定培養(yǎng)基的pH、乳酸含量以及葡萄糖的消耗量可以反映細(xì)胞的糖酵解情況。結(jié)果表明,空載體組與野生型組相比,培養(yǎng)基的pH、乳酸含量、葡萄糖消耗量均無(wú)顯著性差異。但是與野生型組和空載體組相比,過(guò)表達(dá)組培養(yǎng)基的pH顯著降低,乳酸含量以及葡萄糖消耗量顯著增加(圖6～圖8)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的糖酵解加劇,從圖5B可知,三組之間內(nèi)源性PKM1的量一致,由此推斷過(guò)表達(dá)組糖酵解加劇是由外源過(guò)表達(dá)的FLAG-mPKM1造成的。

圖6 培養(yǎng)基pHFig.6 pH values of culture fluid

圖7 培養(yǎng)基乳酸含量Fig.7 Lactic acid content in culture fluid

圖8 各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量Fig.8 Glucose consumption of cells in each group

3 結(jié)論

本研究用“Golden Gate”法構(gòu)建了小鼠PKM1基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,摸索出了慢病毒感染靶細(xì)胞的最佳條件:感染復(fù)數(shù)為30,嘌呤霉素濃度為1.2 μg/mL。成功篩選出了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。過(guò)表達(dá)組中FLAG-PKM1的mRNA表達(dá)量約是對(duì)照組的9.4萬(wàn)倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基的pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗初步證明PKM1促進(jìn)了細(xì)胞的糖酵解。篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為進(jìn)一步研究PKM1蛋白翻譯后修飾對(duì)其自身酶活以及細(xì)胞糖酵解的影響奠定了材料基礎(chǔ)。