王玉霞，崔 霞，周海軍，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

生物絮凝劑因其綠色生態(tài)，無(wú)毒無(wú)害，活性高，不會(huì)引入二次污染，且絮凝的范圍廣，與可能會(huì)引起多種環(huán)境和人類(lèi)健康問(wèn)題相比的無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)合成絮凝劑相比，生物絮凝劑被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型的高效絮凝劑，在污水、廢水的處理和水質(zhì)的凈化中具有很好的發(fā)展前景[1-5]。菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 作為世界上最受歡迎的海洋雙殼類(lèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物之一，其產(chǎn)生的黏附污泥是一種典型的水產(chǎn)養(yǎng)殖副產(chǎn)品廢物。來(lái)自中國(guó)舟山水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的菲律賓蛤仔黏附污泥（R.philippinarum conglutination mud，RPM）被報(bào)道為一種具有前景的天然生物絮凝劑資源，研究發(fā)現(xiàn)RPM 中含有有效絮凝多糖，其共附生微生物可能是絮凝多糖的產(chǎn)生源。RPM 對(duì)不同染料溶液的脫色率均在90%以上，最大絮凝率高達(dá)91.8%[6-7]。從RPM 中分離得到的菌株最大絮凝率可達(dá)88.14%，最大脫色率可達(dá)90.02%[7-8]。

本研究從RPM 中分離篩選得到一株具有高絮凝活性的菌株JP，通過(guò)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建以及生理生化特征對(duì)其鑒定到種。然后通過(guò)Illumina 測(cè)序平臺(tái)對(duì)菌株JP 的全基因組框架進(jìn)行掃描測(cè)序，將測(cè)得序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)并注釋到COG、GO、KEGG、NR 和Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)其代謝功能的分析來(lái)揭示其產(chǎn)絮凝劑的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 產(chǎn)絮凝劑菌株JP 的來(lái)源

從具有高絮凝活性的菲律賓蛤仔黏附污泥中分離、篩選、純培養(yǎng)獲得的菌株。

1.2 絮凝率測(cè)定

菌株的絮凝率參照MU Jun,et al[6]使用的高嶺土懸浮液法進(jìn)行測(cè)定。配制4 g·L-1的高嶺土懸浮液93 mL，分別加入5 mL 10 g·L-1氯化鈣溶液和2 mL 待測(cè)菌株JP 的菌懸液，調(diào)節(jié)pH 至7.5。200 r·min-1攪拌混合液1 min，然后以80 r·min-1攪拌2 min。靜置10 min 后，取液面下1 cm 處懸濁液于便攜式可見(jiàn)分光光度計(jì)在550 nm 吸光度下進(jìn)行光密度值(OD)測(cè)定?？瞻讟悠芬? mL 去離子水代替待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定，絮凝率（flocculation rate，F(xiàn)R）計(jì)算公式為：

A 和B 分別為空白對(duì)照組和待測(cè)樣品組的OD550值。

1.3 生理生化性狀測(cè)定

菌株JP 的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、生長(zhǎng)溫度與鹽度范圍、胞外酶活性檢測(cè)、碳源的利用測(cè)定方法參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]以及BAUMANN,et al[11]。

1.4 16S rDNA 測(cè)序

將菌株JP 接種到液體培養(yǎng)基中恒溫25 ℃培養(yǎng)10 h 后使用TaKaRa 全基因組提取試劑盒(DNA Extraction Kit Ver.3.0)進(jìn)行核酸DNA 的提取和純化。利用引物27F(5’-AGA GTTTGATCATGG CTC AG-3’)和1492R(5’-TAC GGTTACCTGTTACGACTT-3’)對(duì)菌株抽提的核酸進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[12]，反應(yīng)體系終體積為20 μL，包含2.0 μL 10×Ex Taq buffer、1.6 μL 2.5 mmol·L-1dNTP mix、5p 引物27F、5p 引物1492F、0.5 μL 模板、0.2 μL Ex Taq 和14.1 μL ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，90 s，24個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增結(jié)果以凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后使用ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序后的序列進(jìn)行拼接。

1.5 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將拼接后的序列于EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net)進(jìn)行blast 比對(duì)，將菌株鑒定到種屬水平。菌株JP 的16S rDNA 序列上傳到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KX702268。菌株JP 于2016 年8 月29 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.12914。選取相似比對(duì)結(jié)果中相似度高的模式菌株及外間組模式菌株通過(guò)軟件MEGA7 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，分析其進(jìn)化關(guān)系。

1.6 菌株JP 的全基因組框架掃描

將菌株JP 純培養(yǎng)后提取基因組DNA，利用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)并收集抽提的DNA。對(duì)質(zhì)檢收集后的DNA 進(jìn)行300～500 bp 片段化，然后使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，TruSeq PE Cluster Kit 進(jìn)行橋式PCR，最后使用TruSeq SBS Kit 利用Illumina 測(cè)序技術(shù)對(duì)DNA 進(jìn)行paired-end(PE)測(cè)序。將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行有效數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、序列拼接(SOAPdenovo v2.04 軟件)、序列矯正(GapCloser v1.12 軟件)，得到拼接后的序列，以便進(jìn)行下一步分析。

1.7 生物信息學(xué)分析

對(duì)拼接后的序列進(jìn)行rRNA/tRNA 的查找(RNAmmer-1.2 和tRNAscan-SE v1.3.1 軟件)、串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測(cè)(http://tandem.bu.edu/trf/trf.basic.submit.html)[13]、插入序列預(yù)測(cè)(https://www-is.biotoul.fr/)[14]、基因的功能預(yù)測(cè)(Glimmer 3.02 軟件)，并將預(yù)測(cè)基因的蛋白序列與Nr、genes、string 和GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp 比對(duì)(BLAST 2.2.28+軟件)，得到預(yù)測(cè)基因的功能注釋信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 絮凝率、16S 序列比對(duì)結(jié)果及進(jìn)化關(guān)系分析

分離純化的單菌株JP 恒溫25 ℃純培養(yǎng)10 h，測(cè)得其絮凝率為80.0%。比對(duì)結(jié)果顯示菌株JP 的16S序列與Pseudoalteromonas undina NCIMB 2128T 的序列具有100%相似性。菌株JP 的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)如圖1，低于80%的值被隱藏，由圖1 可知，菌株JP 與P.undina 聚集在一個(gè)分支。

菌株的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，菌株JP 為桿狀菌，革蘭氏陰性菌，具有極性鞭毛；生長(zhǎng)鹽度耐受范圍與模式菌株相比，由1%～12%提升到了15%；高溫不耐受，37 ℃無(wú)法生長(zhǎng)；能產(chǎn)生酶有淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、精氨酸和酪氨酸；能利用葡萄糖、麥芽糖，而阿拉伯糖、半乳糖、蜜二糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、檸檬酸鹽、木糖均無(wú)法利用。與模式菌株的理化特征比對(duì)，結(jié)合16S 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，菌株JP 被鑒定為P.undina。

表1 菌株JP 的生理生化特征測(cè)定結(jié)果Tab.1 The results of biochemical tests of strains JP

2.2 菌株JP 的基因組基本特征

為了深入研究RPM 共附生微生物-產(chǎn)絮凝劑微生物的產(chǎn)絮凝劑分子機(jī)制，本研究利用Illumina 技術(shù)對(duì)菌株JP 的基因組進(jìn)行了框架掃描測(cè)序，序列拼接為20 個(gè)大框架序列，總長(zhǎng)度為4 046 116 bp，其中18 個(gè)框架序列長(zhǎng)度大于1 000 bp，最長(zhǎng)框架為885 303 bp，框架N50 為480 011 bp，N90 為113 970 bp，GC 含量為40。將菌株JP 拼接后的序列進(jìn)行與基因預(yù)測(cè)，包含14 個(gè)rRNA、87 個(gè)tRNA 和3 746 個(gè)基因。

2.3 重復(fù)序列預(yù)測(cè)

通過(guò)TRF(tandem repeat finder)對(duì)菌株JP 的基因組進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)序列的在線(xiàn)預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到111 條串聯(lián)重復(fù)序列，44.1%的序列匹配分值為50～100，37.8%的序列匹配分值為101～500，其余匹配分值大于500，表明菌株JP 的基因組中多存在短串聯(lián)重復(fù)序列。通過(guò)IS Finder 對(duì)菌株JP 的插入序列進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)，24條潛在的插入序列被篩選出，篩選結(jié)果以E-value(0.001)為標(biāo)準(zhǔn)，IS3 序列家族占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，僅1 條屬于IS66 家族。

圖2 菌株JP 的基因組CG 圖譜Fig.2 The CG view of P.undina JP

2.4 COG 功能分析

將注釋基因與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明2416 個(gè)(64.5%)基因具有COG 編號(hào)，即具有明確的生物學(xué)功能(圖3)。其中，COG 功能一級(jí)分類(lèi)中參與代謝的蛋白數(shù)最多，高達(dá)1 004 個(gè)(41.6%)，其次是參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程和信號(hào)傳導(dǎo)功能(33.4%)，以及信息儲(chǔ)存和處理(21.4%)。COG 功能二級(jí)分類(lèi)中，擁有最多功能基因的是類(lèi)別J(翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，9.8%)、E(氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，9.6%)、M (細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生，7.4%)和T(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，7.3%)。類(lèi)別Q 的功能基因僅占2.2%(次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝)。

圖3 菌株JP 的COG 的功能分類(lèi)Fig.3 The results of COG second level class in P.undina JP

2.5 GO 功能分析

GO 功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖4 所示。由圖可知，61.3%(2 295)的預(yù)測(cè)基因具有GO 注釋信息。其中，在生物學(xué)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)過(guò)程、單生物過(guò)程和代謝過(guò)程占優(yōu)勢(shì)；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞部位、細(xì)胞膜部位、細(xì)胞膜和細(xì)胞是優(yōu)勢(shì)功能組；在分子功能中，結(jié)合和催化活性占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。菌株JP 是一株具有絮凝活性的功能性菌株，其生長(zhǎng)繁殖代謝是重要的生命活動(dòng)，其中需要大量的相關(guān)代謝、生物調(diào)控以及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸?shù)然虮磉_(dá)，因此可以合理地解釋菌株JP 的這些功能基因表達(dá)占優(yōu)勢(shì)地位。

圖4 菌株JP 的GO 功能分類(lèi)圖Fig.4 Functional classification of GO annotation in P.undina JP

2.6 KEGG 代謝通路分析

將菌株JP 基因組預(yù)測(cè)的基因序列與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示在菌株JP 基因組中預(yù)測(cè)的3 746 個(gè)全長(zhǎng)基因中，有2 094 個(gè)基因（55.9%)匹配到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因，且在其對(duì)應(yīng)的代謝途徑上均進(jìn)行了定位，共參與了193 條KEGG 的代謝途徑。其中參與代謝途徑的總共535 個(gè)基因，參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成有240 個(gè)基因，參與不同環(huán)境的微生物代謝共有165 個(gè)基因。此外，參與碳代謝的有86 個(gè)基因，主要包含肽聚糖、脂多糖、氨基糖、核苷酸糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖的生物合成與代謝。迄今為止，對(duì)于細(xì)菌產(chǎn)絮凝劑機(jī)制的報(bào)道眾說(shuō)紛紜，但其明確的絮凝基因等仍處于探索中，但是目前已有報(bào)道一些胞外絮凝劑多糖的生物合成路徑及關(guān)鍵前體的合成，如纖維素和普魯蘭多糖的合成需要先前體UDP-D-Glucose，黃原膠合成的前體為UDP-Glucose、GDP-mannose 和UDP-glucuronate，可得然膠需要先合成前體UDP-Glucose。本研究中能明確找到這些合成前體，然而關(guān)于目前已經(jīng)明確的eps 合成基因簇并未在注釋的代謝通路中尋找到，但能發(fā)現(xiàn)一些胞外多糖合成酶的關(guān)鍵調(diào)控基因，如纖維素、海藻酸鈉合成最開(kāi)始需要c-di-GMP 與PilZ 的結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)激活[16-18]，銅綠假單胞菌中胞外多糖的合成受AlgR 等基因的調(diào)節(jié)[19]。也發(fā)現(xiàn)了一些目前所報(bào)道的胞外多糖聚合前的重復(fù)單元合成，如UDP-ManNAcA、dNTP-D-Glu、UDP-3-O-(3-acetyl)-GlcNAc 等，這些重復(fù)單元在相應(yīng)的聚合酶作用下聚合成多糖，多糖通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等分泌到胞外，形成胞外多糖絮凝劑，使微生物具有絮凝活性[20-23]。

暫未預(yù)測(cè)到目前已報(bào)道的胞外多糖合成基因簇，有多種原因?qū)е麓私Y(jié)果：一是目前關(guān)于P.undina產(chǎn)絮凝劑這一特征是本實(shí)驗(yàn)室首次研究報(bào)道的功能菌株，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于該菌種的研究呈現(xiàn)明顯的不足；二是由于考慮到研究原因，并未對(duì)菌株JP 進(jìn)行完整的基因組測(cè)序，僅對(duì)框架進(jìn)行掃描，框架之間斷開(kāi)的序列有可能具有功能基因，因此造成數(shù)據(jù)的部分缺失；三是目前關(guān)于微生物產(chǎn)絮凝劑的合成路線(xiàn)仍處于探索階段，其中的原理與機(jī)制大量缺乏，因此造成本研究菌株中預(yù)測(cè)不到胞外多糖的合成基因簇；四是該菌株具有類(lèi)似eps 基因簇的基因所合成的產(chǎn)物承擔(dān)該功能。

2.7 NR 功能分析

將菌株JP 組裝后預(yù)測(cè)的基因注釋到NR 數(shù)據(jù)庫(kù)，97.5%（3 653）的預(yù)測(cè)基因在NR數(shù)據(jù)庫(kù)具有匹配信息。結(jié)果表明24.6%的E 值位于1×10-180～1×10-100，13.7%位于1×10-100～1×10-50，3.9%位于1×10-50～1×10-30，4.1%位于1×10-30～1×10-5；注釋信息表明79.0%的基因序列具有100%的相似性，20.0%的相似性集中在80%～99%，其中97.8%的預(yù)測(cè)基因與Pseudoalteromonas sp.有相似的同源序列，其中35.2%（相對(duì)于注釋到Pseudoalteromonas sp.中相似基因的百分比，下同)的預(yù)測(cè)基因與P.undina 相似，20.2%的預(yù)測(cè)基因與P.tetraodonis相似。菌株JP 與P.undina 同屬一個(gè)物種，且與其余3 個(gè)物種分類(lèi)學(xué)地位相近因此大部分基因功能相似是合理的。

2.8 Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

將菌株JP 的預(yù)測(cè)基因注釋到Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)，2 540 個(gè)基因在該數(shù)據(jù)庫(kù)有注釋信息，占總基因數(shù)的67.8%。對(duì)E 值分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，5.9%基因的E 值位于1×10-10～1×10-5，24.1%位于1×10-30～1×10-5，13.5%位于1×10-50～1×10-30，24.1%位于1×10-100～1×10-50，19.8%位于1×10-180～1×10-100。1.1%的基因序列具有100%的相似性，26.6%的相似性集中在80%～99%，35.3%相似性為60%～79%，24.6%相似性為50%～59%。

2.9 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇

通過(guò)antiSMASH 對(duì)菌株JP 的序列進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測(cè)，分別在JP_scaffold2 和JP_scaffold4 序列中各預(yù)測(cè)到一個(gè)基因簇，分別為鐵載體（siderophore)和細(xì)菌素（bacteriocin)合成基因簇。

3 結(jié)論

從RPM 中分離篩選的高絮凝活性菌株JP 通過(guò)16S 測(cè)序和生理生化指標(biāo)測(cè)定鑒定為P.undina，絮凝活性達(dá)到80.0%。通過(guò)一系列的預(yù)測(cè)對(duì)菌株JP 的基因組進(jìn)行了初步分析，一共預(yù)測(cè)到了87 個(gè)tRNA，14個(gè)rRNA，111 條串聯(lián)重復(fù)序列，24 條插入序列，3 746 個(gè)基因和2 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇。將預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋?zhuān)?4.5%、61.3%、55.9%、97.5%、67.8%的基因分別在數(shù)據(jù)庫(kù)COG、GO、KEGG、NR 和Swiss-Prot 匹配到了相應(yīng)的注釋信息。盡管沒(méi)有注釋到一個(gè)完整的與目前所報(bào)道的胞外多糖代謝路徑一致的，這也有可能是目前這一類(lèi)研究領(lǐng)域數(shù)據(jù)大量缺乏的原因，如果需要進(jìn)一步探索菌株的代謝通路，未來(lái)還需要更深入的分子水平研究。