李思泠 朱鐘慧 李秋月 許春杰 趙 靜 王 炎 田 琳

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系,北京 100069)

肺纖維化是指通過肺組織瘢痕化和肺泡間隔的增厚而損害呼吸氣體交換的多種病癥[1]，是肺組織對(duì)毒物、自身免疫以及感染性反應(yīng)的終末階段[2]。肺纖維化是包括矽肺在內(nèi)的眾多肺部疾病的最終表現(xiàn)，形成過程復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。成纖維細(xì)胞增生在肺纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，一般認(rèn)為，成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞和血液(骨髓源性)，而目前研究[3]顯示,肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是成纖維細(xì)胞的來(lái)源之一，對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要的推動(dòng)作用。

EMT被視為上皮細(xì)胞失去其上皮表型特征而逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型特征的過程。上皮細(xì)胞由于緊密連接，具有細(xì)胞極性，形態(tài)排列緊密，似鋪路石樣，不容易進(jìn)行自由移動(dòng)。相反，間質(zhì)細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，缺少細(xì)胞之間的連接，細(xì)胞形態(tài)變成長(zhǎng)梭形，易于遷移，同時(shí)伴有細(xì)胞表型的改變。國(guó)外學(xué)者[4]和本課題組研究[5-6]都顯示，抑制EMT可以抑制組織器官的纖維化。但Tanjore等[7]發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化小鼠肺內(nèi)EMT來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞極少，這說明EMT來(lái)源的成纖維細(xì)胞極少轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。EMT是如何參與纖維化過程，是否間接參與了成纖維細(xì)胞的活化是本研究擬探討的重點(diǎn)。在EMT過程中，多條信號(hào)通路發(fā)揮作用，上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，其中，核轉(zhuǎn)錄因子Snail參與多條重要信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，能夠介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。本課題組前期研究[6]也顯示，在石英誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程中，Snail的表達(dá)上調(diào)。Snail介導(dǎo)的EMT如何參與組織纖維化，具體機(jī)制并不清楚。近年來(lái)，有研究[8]顯示，上皮細(xì)胞受到損傷后可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，在基因?qū)用嫔象w現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的纖維化標(biāo)志物Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ α1,COL1A1)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ α1,COL3A1)和間質(zhì)標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等基因表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而引起纖維化的發(fā)生。

因此，筆者設(shè)想，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后可以促進(jìn)肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞活化。肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后能否活化肺內(nèi)固有成纖維細(xì)胞從而引起肺纖維化，目前未見報(bào)道。本研究通過體外共培養(yǎng)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(MLE-12)和小鼠胚肺成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，擬討論發(fā)生由Snail介導(dǎo)的EMT的上皮細(xì)胞能否引起肺內(nèi)固有成纖維細(xì)胞的活化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑和儀器

小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株MLE-12(美國(guó)ATCC細(xì)胞研究中心)，小鼠胚肺成纖維細(xì)胞株NIH-3T3(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心),高糖DMEM、胎牛血清(美國(guó)HyClone公司)，青鏈霉素混合液、胰酶、全蛋白提取試劑盒KGP2100(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國(guó)PeproTech公司)，Snai1-shRNAi、陰性對(duì)照病毒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)，Transzol up、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒AT301、qPCR試劑盒AQ141(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，兔多克隆Snail抗體(美國(guó)Abgent公司)，兔多克隆GAPDH抗體、羊抗兔二抗抗體(美國(guó)CST公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek技術(shù)有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo Hybaid公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及TGF-β1刺激細(xì)胞

1.2.1 細(xì)胞分組

對(duì)照組：上室加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，下室加入NIH-3T3;TGF-β1組：上室加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10 ng/mL TGF-β1,下室加入NIH-3T3;MLE-12組：上室加入MLE-12,下室加入NIH-3T3;MLE-12+TGF-β1組：上室MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3。

1.2.2 試驗(yàn)方法

小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(MLE-12)和小鼠胚肺成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)均在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫[95% 濕度，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

用10 ng/mL的TGF-β1刺激MLE-12 48 h可誘發(fā)EMT。

在共培養(yǎng)體系中，使用上室膜孔隙為0.4 μm的六孔Transwell板，在下室接種NIH-3T3，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，上室接種MLE-12，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。待上下室細(xì)胞密度均達(dá)到80%開始進(jìn)行共培養(yǎng)，使用10 ng/mL的TGF-β1刺激上室MLE-12，共培養(yǎng)48 h。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染MLE-12細(xì)胞

1.3.1 細(xì)胞分組

對(duì)照組：上室加入空病毒轉(zhuǎn)染的MLE-12，下室加入NIH-3T3；對(duì)照+TGF-β1組：上室空病毒轉(zhuǎn)染的MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3；Snail-shRNA組：上室加入Snail-shRNA病毒轉(zhuǎn)染的MLE-12,下室加入NIH-3T3；Snail-shRNA+TGF-β1組：上室Snail-shRNA病毒轉(zhuǎn)染的MLE-12培養(yǎng)中加入TGF-β1,下室加入NIH-3T3。

1.3.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳染毒條件慢病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=50對(duì)MLE-12進(jìn)行轉(zhuǎn)染(陰性對(duì)照病毒、Snail-shRNA病毒)，轉(zhuǎn)染72 h后進(jìn)行傳代，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。

1.4 熒光定量PCR法檢測(cè)EMT及纖維化相關(guān)基因表達(dá)

使用Tranzol up提取細(xì)胞總RNA，使用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品總RNA濃度及純度，用于對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到cDNA。將cDNA稀釋3倍后，取1 μL作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板，用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃，5 s；變性94 ℃，5 s；退火58 ℃，15 s；延伸72 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)數(shù)。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。上皮標(biāo)志物E鈣粘蛋白(E-cadherin，CDH1)、間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、核轉(zhuǎn)錄因子Snail、纖維化標(biāo)志物COL1A1、COL3A1的Ct值經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)化后，根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算各樣品相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列詳見表1。

表1 mRNA引物序列(小鼠)

1.5 Western blotting檢測(cè)Snail蛋白表達(dá)

細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)的提取按蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行，BCA法測(cè)定各樣品蛋白質(zhì)濃度，加入5×SDS蛋白上樣電泳緩沖液，沸水浴10 min，冷卻至室溫。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)Snail蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組以上的均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)及LSD多重比較檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)MLE-12細(xì)胞形態(tài)及EMT相關(guān)表型的影響

誘導(dǎo)48 h后，光鏡下可見對(duì)照組MLE-12細(xì)胞狀態(tài)良好，保持了上皮樣形態(tài)；TGF-β1誘導(dǎo)組MLE-12細(xì)胞則呈現(xiàn)出紡錘形(圖1)。RT-qPCR結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)48 h后，MLE-12的CDH1 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低，而α-SMA以及核轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA 表達(dá)量則升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖2。

圖1 TGF-β 1(10 ng/mL)刺激48 h對(duì)MLE-12細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of TGF-β 1 (10 ng/mL) on the morphology of MLE-12 cells stimulated by 48 h(10×) A:before stimulation； B: after stimulation; TGF-β 1：transforming growth factor-β 1.

圖2 TGF-β 1刺激48 h對(duì)MLE-12 CDH1、α-SMA、Snail mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of TGF-β 1 on the expression of CDH1, α-SMA, Snail mRNA of MLE-12 cells stimulated by 48 h TGF-β 1：transforming growth factor-β 1; CDH1：E-cadherin； α-SMA：α-smooth muscle actin; *P<0.05, ** P<0.01 vs control; n=3.

圖3 上室不同條件共培養(yǎng)48 h對(duì)NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of 48 h of co-culture on the expression of α-SMA, COL1A1 and COL3A1 mRNA of NIH-3T3 in different conditions of insert*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05， ##P<0.01 vs MLE-12; &&P<0.01 vs TGF-β 1; n=3； TGF-β 1:transforming growth factor-β 1;α-SMA:α-smooth muscle actin:COL1A1：collagen Ⅰ α1; COL3A1：collagen Ⅲ α1.

2.2 發(fā)生EMT的MLE-12能夠促進(jìn)NIH-3T3的活化

與空白對(duì)照相比，TGF-β 1與MLE-12都可引起下室NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的上調(diào)。經(jīng)由TGF-β 1誘導(dǎo)的MLE-12引起下室NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的上調(diào)程度分別高于TGF-β 1和MLE-12的單獨(dú)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3。

2.3 敲減MLE-12的Snail基因能夠抑制共培養(yǎng)體系NIH-3T3的活化

慢病毒處理MLE-12后，相對(duì)于空病毒對(duì)照組，Snail-shRNA慢病毒可明顯降低MLE-12的Snail mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖4、圖5。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后MLE-12 Snail mRNA表達(dá)Fig.4 Expression of Snail mRNA of MLE-12 cells after lentivirus transfection ** P<0.01 vs control; n=3.

與對(duì)照組相比，TGF-β 1可引起下室NIH-3T3 成纖維標(biāo)志物α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的上調(diào)，相比于Snail-shRNA-MLE-12，由TGF-β 1誘導(dǎo)的Snail-shRNA-MLE-12同樣可引起下室NIH-3T3 成纖維標(biāo)志物α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的上調(diào)。但相對(duì)于對(duì)照+TGF-β 1組，由TGF-β 1誘導(dǎo)的Snail-shRNA-MLE-12可下調(diào)下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染后MLE-12 Snail 蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Snail protein of MLE-12 cells after lentivirus transfection ** P<0.01 vs control; n=3.

圖6 上室不同條件共培養(yǎng)48 h對(duì)NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)影響Fig.6 Effects of 48 h of co-culture on the expression of α-SMA, COL1A1 and COL3A1 mRNA of NIH-3T3 in different conditions of insert *P<0.05, **P<0.01 vs control;##P<0.01 vs Snail-shRNA,&P<0.05,&&P<0.01 vs control+TGF-β 1;n=3;TGF-β 1:transforming growth factor-β 1; α-SMA: α-smooth muscle actin; COL1A1：collagen Ⅰ α1； COL3A1：collagen Ⅲ α1.

3 討論

肺纖維化是多種肺部疾病的最終表現(xiàn)結(jié)果，一般指多種原因?qū)е路谓M織損傷后的病理過程，早期表現(xiàn)為彌漫性肺炎，后期為成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積[9]。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難并伴刺激性干咳，且隨著病情進(jìn)展，患者呼吸功能不斷惡化，最終演變?yōu)楹粑ソ呱踔了劳鯷10]。肺纖維化可由各種急性和慢性肺損傷引發(fā)[11]，是一種復(fù)雜的肺間質(zhì)疾病，基因異常、自身免疫、職業(yè)暴露、創(chuàng)傷、藥物及病原微生物感染等多種因素均可引起肺纖維化的發(fā)生。例如，矽肺就是石英粉塵的職業(yè)暴露引起的肺部彌漫性纖維化為主的全身性疾病，是我國(guó)目前常見的且危害較為嚴(yán)重的職業(yè)病，已經(jīng)成為我國(guó)亟待解決的公共衛(wèi)生問題。不論是何種病因，肺纖維化在細(xì)胞水平上都體現(xiàn)為一些持續(xù)或反復(fù)損傷的修復(fù)反應(yīng)，或?qū)τ诖碳さ漠惓Ｕ{(diào)節(jié)以及不恰當(dāng)?shù)男迯?fù)[12]。由于發(fā)病機(jī)制不明，目前臨床上缺乏療效顯著的治療藥物[13]。探索肺纖維化的發(fā)病機(jī)制以延緩或阻斷其發(fā)生發(fā)展的策略，具有重要的實(shí)際意義。

在肺纖維化疾病中，成纖維細(xì)胞的增生發(fā)揮重要作用。近年來(lái)有研究[3]顯示EMT是成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源之一，并且對(duì)纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要推動(dòng)作用。Iwano等[14]在腎臟纖維化的腎間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein1,FSP1)、波形蛋白、α-SMA的高表達(dá)，在腎纖維化發(fā)生期間，F(xiàn)SP1表達(dá)陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞也通過局部EMT大量出現(xiàn)，證明了上皮細(xì)胞可以通過EMT導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的活化和纖維化發(fā)生。Zeisberg等[15]通過譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化病灶內(nèi)，大量的成纖維細(xì)胞來(lái)源于發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞。Kim等[3]在特發(fā)性肺纖維化患者的肺上皮細(xì)胞中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了上皮和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí)發(fā)生EMT的肺泡上皮細(xì)胞是纖維化病灶中間質(zhì)細(xì)胞的主要來(lái)源之一。在EMT過程中，多條信號(hào)通路發(fā)揮作用，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，促上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，其中，核轉(zhuǎn)錄因子Snail參與包括TGF-β通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，在肌成纖維細(xì)胞活化過程中起到重要作用。TGF-β是一種促分泌的蛋白，能夠影響細(xì)胞的自分泌及旁分泌。TGF-β主要包括3種類型，即TGF-β 1、TGF-β2和TGF-β3，其中，TGF-β 1在包括腫瘤和纖維化等病理過程的發(fā)生發(fā)展中都起到重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β 1在所有哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中都有表達(dá)，是誘導(dǎo)EMT的重要細(xì)胞因子。在一些體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞中，單純使用TGF-β 1刺激就可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[16]。TGF-β 1在肺纖維化疾病中是一個(gè)重要的促纖維化因子，在矽肺中，石英刺激巨噬細(xì)胞后主要通過分泌TGF-β 1，作用于包括肺泡上皮細(xì)胞在內(nèi)的特異的靶細(xì)胞，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，成纖維細(xì)胞增生和膠原合成并活化為肌成纖維細(xì)胞，分泌膠原蛋白，最終引起肺纖維化[17]。因此在本研究中，使用TGF-β 1的刺激建立肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT模型。結(jié)果顯示，使用TGF-β 1刺激MLE-12 48 h后，與對(duì)照組相比，MLE-12在形態(tài)學(xué)上由鋪路石樣形態(tài)變?yōu)榧忓N形，呈現(xiàn)間質(zhì)樣變化；在基因表達(dá)方面，與對(duì)照組相比，上皮標(biāo)志物CDH1表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)，并且Snail基因表達(dá)顯著升高，這表明TGF-β 1能夠誘導(dǎo)MLE-12發(fā)生EMT。

國(guó)外學(xué)者[4]和本課題組的前期研究[5-6]都顯示抑制EMT與抑制組織器官纖維化關(guān)系密切。本課題組在前期研究[5-6]顯示， 骨形態(tài)發(fā)生蛋白7可以抑制大鼠矽肺模型中的肺纖維化，這可能與肺組織中EMT的抑制有關(guān)。然而，有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)，EMT來(lái)源的成纖維細(xì)胞極少活化為肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)合成以及纖維化疾病發(fā)生中起關(guān)鍵作用，這提示EMT可能不是通過直接轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞在纖維化疾病中發(fā)揮作用。EMT究竟如何參與纖維化的發(fā)生已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，Richeldi等[8]發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞受到刺激后，可以通過旁分泌的方式促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化，進(jìn)而引起纖維化的發(fā)生。本課題組結(jié)合前期研究以及國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[8]，認(rèn)為旁分泌可能在纖維化發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，因此，通過在體外建立上皮-間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，模擬旁分泌模型，擬探討上皮細(xì)胞能否通過旁分泌的方式引起成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞。本研究通過建立MLE-12與NIH-3T3共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)環(huán)境的相互作用，探討上皮細(xì)胞發(fā)生EMT能否活化成纖維細(xì)胞進(jìn)而引起纖維化的發(fā)生。本研究表明，在MLE-12與NIH-3T3共培養(yǎng)體系中，發(fā)生EMT的MLE-12能顯著誘導(dǎo)NIH-3T3 α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)的上調(diào)。該研究結(jié)果提示發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞能夠引起成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞。但發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞具體通過旁分泌哪種細(xì)胞因子發(fā)揮作用，還有待繼續(xù)研究。

Lovisa等[18]發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化小鼠模型中，纖維化病灶內(nèi)的腎小管上皮細(xì)胞中Snail表達(dá)量豐富，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞Snail基因進(jìn)行敲除后，腎小管上皮細(xì)胞EMT被抑制，腎纖維化減輕。本課題組的前期研究[19]也顯示在石英誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，Snail表達(dá)上調(diào)。Snail是轉(zhuǎn)錄抑制因子中的一員，是連接多個(gè)信號(hào)通路的中心分子，如核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路等，并且已被證實(shí)可以抑制上皮標(biāo)志物CDH1的表達(dá)[20-21]。抑制上皮細(xì)胞的Snail能否抑制成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，是本研究的研究重點(diǎn)。在本研究中，對(duì)MLE-12分別使用Snail慢病毒和陰性對(duì)照病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用轉(zhuǎn)染后的MLE-12與NIH-3T3建立共培養(yǎng)體系，并用TGF-β 1對(duì)MLE-12進(jìn)行刺激，結(jié)果表明，與TGF-β 1+陰性對(duì)照病毒組相比，TGF-β 1+Snail慢病毒轉(zhuǎn)染組下室NIH-3T3 的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)上調(diào)程度降低。該結(jié)果提示，抑制上皮細(xì)胞Snail基因的表達(dá)可以抑制其對(duì)成纖維細(xì)胞的活化作用。

本研究證實(shí)了Snail介導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT可引起成纖維細(xì)胞的活化，敲減Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的Snail基因可以抑制成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞。 提示Snail介導(dǎo)的肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在肌成纖維細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。