司艷芳，李 鵬，郭東光，孫國鵬，岳 鋒，王選年

(1.新鄉(xiāng)學院 生命科學技術學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學 生命科學技術學院，河南 鄭州 450000)

西馬特羅(Cimaterol,CIM)也稱喜馬特洛、塞曼特羅，為白色晶體結構，極性中等。西馬特羅能影響生豬體內的物質代謝，促進腺苷酸環(huán)化酶的合成，減少脂肪的合成并促進其分解，增加肌肉中蛋白質含量[1]。其與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等10余種物質類似，屬于β2型腎上腺類受體激動劑，俗稱為瘦肉精，在20世紀80年代，由美國科研人員發(fā)現(xiàn)[2]。近年來，許多不法飼養(yǎng)業(yè)受到利益驅動，在動物的飼糧或飲水中添加西馬特羅，長期使用會造成西馬特羅在動物組織內蓄積殘留。人在攝食了瘦肉精高殘留的動物組織，輕者會出現(xiàn)頭疼目眩、惡心嘔吐等不適癥狀，重者會引起食用者中毒，嚴重的甚至有生命危險[3]。自從世界上首次發(fā)生瘦肉精中毒事件，已累計有近萬人中毒。食品安全控制中心為了達到控制西馬特羅的目的，篩查工作通常分2個階段進行：先進行免疫化學篩選，然后進行氣相色譜-質譜(GC-MS)或液相色譜-質譜(LC-MS)進一步確認。這樣可以精準鑒定樣本中是否含有西馬特羅等非法添加物，但上述儀器昂貴且操作復雜，對于大部分企業(yè)難以實現(xiàn)日常的監(jiān)測[4]。

β2型受體激動劑在動物生產(chǎn)中的廣泛應用帶來了一系列食品安全問題。隨著食品安全法規(guī)越來越嚴格，開發(fā)快速、靈敏的方法來檢測肉類、加工食品和乳制品中非法添加物的殘留具有至關重要的意義[5]。目前，競爭ELISA測定法用于定量檢測非法添加物，具有簡單、快速、對大樣本敏感、特異性好且成本低等優(yōu)點，引起了極大關注。為此，應用西馬特羅免疫抗原免疫兔子，制備多克隆抗體，旨在建立其快速檢測方法，為β2型受體激動劑殘留藥物檢測方法的建立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

西馬特羅及其他小分子標準品、牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑均購自Sigma-Aldrich公司;TMB單組分顯色液及HRP標記羊抗兔IgG購自Solarbio公司；TEMED、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨等購自華美生物公司。

1.2 主要儀器

磁力攪拌器、紫外全波長掃描儀、分光光度計、酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)搖床、蛋白電泳儀。

1.3 主要溶液體系

透析液：0.01 mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；包被液：0.05 mol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)；洗脫液(PBST)：含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH值為7.4)；封閉液：含5%脫脂奶粉的PBST；終止液：2 mol/L H2SO4溶液。0.1 mol/L濃鹽酸溶液：50 mL蒸餾水中含450 μL濃鹽酸溶液，pH值為2；0.15 mol/L NaNO2溶液：0.517 g NaNO2溶于50 mL蒸餾水；5%尿素：2.5 g尿素溶于50 mL蒸餾水；0.1 mol/L 硼酸緩沖液(含0.15 mol/L NaCl)：3.09 g H3BO3，4.383 g NaCl,溶于500 mL水中，pH值為8.6。

1.4 免疫抗原的制備

(1)將4 mg西馬特羅標準品溶于0.1 mol/L濃鹽酸溶液(pH值為2)中混勻，濃鹽酸溶液需要提前放置冰上預冷30 min。(2)向上述溶液勻速逐滴加入預冷的0.15 mol/L的NaNO2溶液，在冰上避光操作，同時使用淀粉碘化鉀試紙監(jiān)控，直至試紙變成藍紫色時停止加入。(3)避光低溫低速攪拌4～4.5 h。(4)用NaOH將溶液調至pH值為7.4，5%尿素水溶液中和過量的NaNO2，每次滴加均用淀粉淀化鉀試紙檢測，試紙由深藍變?yōu)闇\藍，即停止，反應液低溫保存?zhèn)溆谩?5)稱取17 mg BSA粉末溶于1 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH值為8.6)，將第4步所得混合液逐滴加入到BSA蛋白溶液中，放于4 ℃避光低速攪拌24 h。(6)將反應得到的亮黃色偶聯(lián)產(chǎn)物收集在透析袋中(透析袋使用前在沸水中煮沸10 min)，在PBS中低溫透析3 d，每間隔8 h換一次透析液[6-8]。

1.5 檢測抗原的制備

圖1 西馬特羅的分子結構Fig.1 Molecular structure of cimaterol

圖2 西馬特羅完全抗原的制備流程Fig.2 Preparation process of cimaterol complete antigen

1.6 抗原的表征與鑒定

1.6.1 SDS-PAGE鑒定完全抗原 SDS-PAGE凝膠電泳分離膠和濃縮膠的含量與目的蛋白的分子質量有關[9]。本試驗選用的載體蛋白BSA、OVA的相對分子質量分別為66.4 ku、42.3 ku。目的蛋白分子質量在30～100 ku，應使用的濃縮膠含量為5%，分離膠含量為10%，凝膠配制參照《分子生物學實驗》。濃縮膠電壓選擇120 V，分離膠電壓選擇80 V，凝膠厚度1.5 mm，上樣量為2 μg，考馬斯亮藍染色3～4 h后，置脫色液中過夜脫色。偶聯(lián)小分子的載體蛋白的完全抗原大于單純的載體蛋白分子質量，遷移速率小。由此可以判斷出載體蛋白上是否偶聯(lián)有小分子，另外根據(jù)分子質量還可以初步計算完全抗原的偶聯(lián)比。

1.6.2 紫外全波長掃描法鑒定完全抗原 一般蛋白質的最大吸收峰在280 nm波長處，載體蛋白偶聯(lián)小分子后，其最大吸收峰會發(fā)生偏移，或產(chǎn)生新的吸收峰。用紫外吸收法測定其蛋白質的濃度和特征峰，在波長200～500 nm范圍內進行紫外掃描，根據(jù)吸收峰的變化判斷是否偶聯(lián)成功[10]。

1.6.3 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和高分辨質譜(ESI-MS)法鑒定完全抗原 MALDI-TOF-MS和ESI-MS系統(tǒng)能精準地對完全抗原進行分子質量測量，采用 MALDI-TOF-MS 和 ESI-MS 質譜同時進行的策略，目的在于有效消除試驗及測量過程中的誤差，可以更加精確地計算西馬特羅與載體蛋白的偶聯(lián)比[11-12]。

1.7 多克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立

1.7.1 動物免疫 取3月齡健康潔凈級新西蘭大白兔3只(購自鄭州大學實驗動物中心)，首免用免疫原CIM-BSA與弗氏完全佐劑充分乳化，免疫劑量為500 μg/只，背部皮下多點注射；2免、3免均用弗氏不完全佐劑，每次免疫間隔14 d[13]。3免后第10天耳緣靜脈采血，測定血清效價，選擇血清效價高且對西馬特羅抑制作用強的兔子，分離其血清進行后續(xù)試驗。

1.7.2 多克隆抗體效價測定 多克隆抗體用間接ELISA法檢測效價。包被：以CIM-OVA偶聯(lián)物為包被原，用包被液稀釋至2 μg/mL，分別加入96孔ELISA反應板，每孔加入50 μL，4 ℃ 包被過夜。封閉：棄去包被液，以 PBST 連續(xù)洗板5次，最后一次間隔 5 min，于干凈的吸水紙上輕拍至沒有明顯水珠，每孔加入 200 μL 5% 脫脂奶粉-PBST 作為封閉液，37 ℃條件下封閉1 h。孵育一抗：用洗滌液PBST洗板5次，拍干，以經(jīng)封閉液稀釋后的兔源多抗血清為一抗(稀釋范圍1∶1 000～1∶128 000)，每孔加入50 μL，37 ℃條件下孵育30 min，同時設置未免疫的血清為陰性對照。孵育二抗：用PBST洗板5次，拍干，以HRP標記羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗，每孔加入 50 μL，37 ℃條件下反應30 min。終止及顯色：用洗滌液PBST連續(xù)洗板5次，拍干后每孔加入 50 μL TMB顯色液，室溫避光條件下反應10 min，加入25 μL 2 mol/L的H2SO4終止液終止顯色。讀數(shù)：用全波長的酶標儀在450 nm處測定吸光值[14-15]。

1.8 間接競爭ELISA檢測方法的評估

1.8.1 靈敏度測定 將上述ELISA 操作中的一抗換成最佳稀釋度的抗體，加入不同質量濃度的西馬特羅標準品溶液，其他操作相同。以添加標準品對包被抗原 50% 抑制濃度作為半數(shù)抑制濃度(IC50)。西馬特羅小分子競爭品的最適質量濃度的確定方法為：先選取10、100、1 000、5 000 μg/L作為添加西馬特羅的質量濃度，初步確定西馬特羅標準品對血清的半數(shù)抑制濃度，然后縮小范圍建立標準曲線并精確計算半數(shù)抑制濃度[16-17]。

1.8.2 特異性測定 將1.8.1方法中的西馬特羅標準品溶液換成不同質量濃度的其他類型β2型受體激動劑標準品溶液。然后通過間接競爭ELISA 繪制出多克隆抗體對各小分子標準品的標準抑制曲線，求出各藥物的半數(shù)抑制濃度，判斷制備的多克隆抗體的特異性[18]。計算交叉反應率：交叉反應率(CR)= IC50(CIM)/IC50(競爭物)×100%。

不知是為了打擊她的囂張氣焰，還是出于什么曖昧的動機，我把我找工作的詳情對葉靄玲說了。我告訴葉靄玲說，這份工作完全是仰仗白麗筠的結果，她在中間幫了很大的忙。如我預料的一樣，立即遭到了她的嘲笑。葉靄玲一定是滿懷嫉妒，報之以冷笑，說，她幫你找到了工作，你拿什么報答她呀？

1.8.3 最低檢測限測定 根據(jù)統(tǒng)計學方法，使用最佳條件，按照間接競爭ELISA檢測方法對抑制品進行檢測，記錄其OD值，抑制率99%時對應的小分子藥物質量濃度為最低檢測限，反映該檢測方法的靈敏度[19]。

1.8.4 親和力測定 抗體與特異性抗原的親和力越高，則靈敏度越高，即檢出限越低。親和力常數(shù)為最低檢出量(靈敏度)的倒數(shù)，通常用K表示，單位是升/摩爾(L/mol)[20]。

1.8.5 回收率測定 分別用豬尿液和飼料進行樣品的添加回收試驗。所用的豬尿和飼料均取自新鄉(xiāng)縣養(yǎng)殖場，飼料按照國家標準《 飼料中16種β2型受體激動劑液相色譜-串聯(lián)質譜法的測定》的規(guī)定，采用甲醇提取處理，并用稀釋的方法消除樣品基質效應，豬尿進行離心去除雜質[21]。參照間接競爭ELISA方法，向預處理之后的陰性飼料樣品和豬尿樣品中分別添加0.5、1.0、10.0 μg/L的小分子標準品，同時設置陰性對照孔。按照上述間接競爭ELISA最佳條件操作，重復試驗3次，計算OD450平均值和樣品的含量。

2 結果與分析

2.1 完全抗原的鑒定

2.1.1 SDS-PAGE鑒定 載體蛋白偶聯(lián)半抗原后會導致在SDS-PAGE電泳中泳動速度變慢。SDS-PAGE 鑒定結果表明，BSA和OVA的泳動速度均大于CIM-BSA 和 CIM-OVA(圖3)，證明西馬特羅與BSA和OVA偶聯(lián)成功。

圖3 CIM-BSA、CIM-OVA的SDS-PAGE鑒定Fig.3 SDS-PAGE indentification of CIM-BSA,CIM-OVA

2.1.2 UV鑒定 通常載體蛋白上偶聯(lián)小分子后，其最大吸收峰會發(fā)生偏移，或產(chǎn)生新的吸收峰。如圖4所示，分別掃描了緩沖溶液PBS、載體蛋白和載體蛋白-半抗原，用緩沖溶液校準去除基質的干擾，比較載體蛋白和偶聯(lián)物的最大吸收峰波長的區(qū)別，明顯出現(xiàn)了非同于載體蛋白在280 nm處的新吸收峰，可以基本判斷人工完全抗原偶聯(lián)成功。

2.1.3 質譜鑒定 單個西馬特羅的分子質量為219.28 u，載體蛋白BSA分子質量為66.4 ku。通過質譜分子質量測定計算偶聯(lián)比，測試品CIM-BSA的分子質量為68 156.9 u，相比單獨載體蛋白BSA的分子質量增加了1 756.9 u，說明CIM-BSA完全抗原偶聯(lián)成功，經(jīng)計算偶聯(lián)比約為8∶1(圖5A)；同理，測試品CIM-OVA的分子質量為44 382.5 u，與單獨的載體蛋白OVA的相對分子質量相比，增加的分子質量為2 082.5 u，約為單個西馬特羅的分子質量的10倍，說明CIM-OVA完全抗原偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比約為10∶1(圖5B)。

圖4 CIM-BSA、CIM-OVA紫外掃描鑒定Fig.4 UV scanning identification of CIM-BSA,CIM-OVA

圖5 CIM-BSA、CIM-OVA質譜鑒定Fig.5 The mass spectrometry identification of CIM-BSA,CIM-OVA

2.2 多克隆抗體的效價測定

將第3次免疫10～14 d后的兔血清倍比稀釋后，間接ELISA檢測血清的效價(表1)。當450 nm波長處的吸光值是陰性孔的2.1倍時，記為陽性孔。陽性孔的最大稀釋度是多克隆抗體的效價。經(jīng)計算，制備的完全抗原免疫效果良好，抗體效價達到1∶64 000。

表1 免疫血清間接ELISA效價測定Tab.1 The immunity serum titer measured by indirect ELISA

2.3 間接競爭ELISA檢測方法的評估

2.3.1 靈敏度測定及標準曲線的建立 由添加西馬特羅標準品的間接競爭ELISA試驗結果可知，抗西馬特羅血清的半數(shù)抑制濃度在1～5 μg/L。故選擇小分子抑制品標準溶液質量濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μg/L，對結果進行處理并建立標準曲線。如表2，無抑制品的對照孔OD450值為1.222，其IC50約為4.26 μg/L。根據(jù)此檢測方法建立標準曲線,y=-0.246 9x+0.662 3(圖6)。曲線的擬合度為0.977 1，說明測量中數(shù)值誤差較小，曲線的擬合效果良好。

表2 CIM標準品間接競爭ELISA檢測結果Tab.2 The results of CIM standard solution measured by indirect competitive ELISA

圖6 間接競爭ELISA標準曲線的建立Fig.6 Standard curve established by indirect competition ELISA

2.3.2 特異性測定 用于抗體交叉反應性研究的競爭物為其他β2型激動劑藥物如鹽酸克倫特羅(CL)、萊克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇(SAL)、鹽酸多巴胺(DH)、溴布特羅(BRO)、班布特羅(BAM)、齊帕特羅(ZIL)、特布他林(TBL)、達氟沙星(DAN)、泰樂菌素(TYL)。由表3可知，免疫血清與其他小分子藥物的交叉反應率均小于0.01%，說明獲得的多克隆抗體的特異性良好，可以用于西馬特羅殘留檢測。

表3 免疫血清與其他藥物的交叉反應率Tab.3 Cross-reactivity rate between immunity serum and other drugs

2.3.3 最低檢測限 根據(jù)標準曲線可知，該間接競爭ELISA檢測方法對西馬特羅的最低檢出限為0.04 μg/L。

2.3.4 親和力常數(shù) 在本試驗中影響親和力常數(shù)最重要最關鍵的是完全抗原的質量。根據(jù)最低檢測限計算，親和力常數(shù)可達10-13L/mol。

2.3.5 回收率 由表4可知，豬尿中西馬特羅的回收率介于96.3%～103.9%，飼料中的回收率介于67.0%～105.0%。

表4 添加樣品回收試驗結果Tab.4 The recovery results of addimg samples

3 結論與討論

與其他方法相比，間接競爭ELISA檢測方法具有靈敏度高、快速、簡便的優(yōu)勢，為殘留檢測提供了重要手段。獲得良好的抗體是建立該方法的必要條件，西馬特羅由于自身分子質量較小，不具有免疫原性，必須將其連接到一些大分子蛋白質載體上成為完全抗原。完全抗原進入動物體內借助載體蛋白的T細胞表位間接誘導B細胞激活、分化、增殖，使其同時具備T細胞表位和B細胞表位，進而刺激B淋巴細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生針對半抗原小分子的特異性抗體。有研究證實，含有苯胺基的半抗原，在制備其完全抗原時，采用重氮化法獲得的偶聯(lián)效果最佳。職愛民等[22]利用重氮化法制備了西馬特羅完全抗原，免疫小鼠獲得多克隆抗體，該抗體對西馬特羅的IC50為86.9 μg/L，這是國內首例有關西馬特羅完全抗原的合成及免疫學分析方法的報道。相比之下，本研究利用多克隆抗體血清建立的檢測西馬特羅的間接競爭ELISA方法的IC50為4.26 μg/L，在靈敏度方面，該方法具有明顯優(yōu)勢。HAUGHEY等[23]研制出能同時檢測多種β2型激動劑的膠體金免疫層析試紙條，其對克倫特羅的靈敏度最高，檢測線性范圍為0.31～4.52 μg/L，IC50為1.18 μg/L，最低檢測限為0.14 μg/L,但與沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林、西馬特羅等藥物均有交叉。陰性豬尿的樣品添加回收試驗中，其回收率在83.6%～102.2%。本研究建立的檢測西馬特羅的間接競爭ELISA方法，針對西馬特羅殘留進行特異性測定，與其他藥物無交叉反應，檢測范圍為0.1～12.8 μg/L，在此范圍內線性擬合關系良好。該方法的最低檢測限為0.04 μg/L，豬尿中西馬特羅的回收率介于96.3%～103.9%，飼料中的回收率介于67.0%～105.0%。本研究在飼料樣品中進行添加回收試驗，增加了對該檢測方法的實用性評價，且該檢測方法不僅可以對西馬特羅進行定量檢測，還可對其進行定性檢測。近年來，為了提高西馬特羅檢測精確度，ZHANG等[24]用磷光二氧化硅納米顆粒標記西馬特羅免疫層析試紙條，結果表明，其最低可檢測到匹克級的痕量殘留，具有簡便、直觀等優(yōu)點。相比于本研究建立的間接競爭ELISA方法，試紙條的檢測速度快，但假陽性率較高。

綜上，本研究利用獲得的抗西馬特羅多克隆抗體，建立了間接競爭ELISA方法，具有良好的特異性、靈敏性、準確性。