馮 華，劉晴坤，2，任春曉，2,劉運(yùn)超，張改平，2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科(Circovirus)、圓環(huán)病毒屬(Circoviridae)，是一類無(wú)囊膜的、直徑在17～22 nm的單鏈環(huán)狀DNA病毒[1-2]，該病毒是引起一系列重要豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus disease，PCVD)的主要病原[3-5]。其中，PCV2系統(tǒng)性疾病(PCV2-systemic disease，PCV2-SD)是主要由PCV2b病毒引起的一種系統(tǒng)性疾病，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大、腹瀉等。該病主要影響7～16周齡的仔豬，能夠造成4%～30%的發(fā)病率和4%～20%死亡率，從而使豬場(chǎng)大量減產(chǎn)，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

PCV2基因組由大小約為1.7 kb的雙義DNA組成，包含2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)：ORF1(904 bp)和ORF2(702 bp)[7]，分別編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)ep(Rep′)和病毒結(jié)構(gòu)蛋白Cap。其中，Cap蛋白是PCV2病毒的主要功能性蛋白，主要行使細(xì)胞受體識(shí)別、核酸細(xì)胞核運(yùn)送等功能[8]。同時(shí)，Cap蛋白也是PCV2主要的免疫原蛋白，包含重要的病毒中和表位，在體外能夠自組裝成病毒樣顆粒(VLP)，常作為血清學(xué)檢測(cè)和疫苗研發(fā)的靶標(biāo)蛋白[9]。大量研究表明，在PCV2 Cap蛋白C端插入外源表位能夠同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)Cap和外源表位的免疫反應(yīng)[10-11]。因此，在Cap蛋白C端插入其自身的中和表位將有助于進(jìn)一步提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效率。目前，Cap 蛋白上共鑒定出至少6個(gè)表位區(qū)域[12-14]，中和表位226LKDPPLNP233被證實(shí)具有較好的中和免疫原性，能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，并參與Cap蛋白構(gòu)象表位的形成，在亞單位疫苗的研發(fā)中具有很好的前景[15-16]。

目前，市場(chǎng)上針對(duì)PCV2的疫苗仍然以滅活疫苗為主。相比滅活疫苗，Cap亞單位疫苗免疫原性單一，可以避免潛在的由于滅活不完全造成的免疫動(dòng)物攜帶疫苗毒的可能，在未來(lái)PCV2清除中將會(huì)具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。為進(jìn)一步提高現(xiàn)有亞單位疫苗免疫效率，以目前流行的PCV2b為研究對(duì)象，將其自身中和表位226—233位氨基酸序列連接到Cap蛋白C末端，成功構(gòu)建連接自身中和表位的嵌合Cap蛋白，并對(duì)其免疫原性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行初步鑒定，以期為研發(fā)更為安全、有效、廉價(jià)的PCV2疫苗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 載體、菌種及主要試劑

重組載體PE-Sumo載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌克隆感受態(tài)細(xì)胞JM109和表達(dá)用感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、DNA Marker DL2000、Primer STAR Max DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶等均購(gòu)自Takara公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ和XbaⅠ購(gòu)自NEB 公司；核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自INALCO 公司；Ni-NTA親和層析柱購(gòu)自QIAGEN 公司；蛋白質(zhì)Marker、Sumo蛋白酶購(gòu)自Smobio公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和ECL 顯色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自Abcam公司；鼠源PCV2 Cap單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的制備和重組表達(dá)菌體的構(gòu)建

利用已經(jīng)針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的PCV2b(GenBank:AAY969004.1)Cap序列為模板，分別以Capc-F：ATGGTCTCTAGGTATGACGTACCCTCGT和Capc-R：AGTCTAGATTACGGGTTCAGCGGCGGGTCTTTCAGGGGGTTCAAAGGTGGG-T(下劃線代表中和表位位置)為上、下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，將PCV2 Cap中和表位基因構(gòu)建在Cap基因C端(Capc)；目的片段經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BsaⅠ和XbaⅠ酶切后，利用T4連接酶將其連接在PE-Sumo載體,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌克隆感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑選陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將其送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將構(gòu)建成功的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為PE-Sumo-Capc。

1.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化和可溶性分析

將PE-Sumo-Capc轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有Amp+的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆接種于含0.1% Amp+的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后，以1∶100比例將其接種至新鮮的Amp+LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6 時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，分別在18、22、26、30 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)10～12 h，優(yōu)化表達(dá)時(shí)間。之后，按照上述方法在最適表達(dá)溫度下，分別表達(dá)8、10、12、14、16 h，探索最適表達(dá)時(shí)間。將收獲的菌體分別重懸于緩沖液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH值為8.0)中，超聲破碎菌體分離上清、沉淀，并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)的最適表達(dá)條件及其可溶性進(jìn)行鑒定。

1.4 重組蛋白的純化及免疫反應(yīng)性鑒定

收集在優(yōu)化條件下表達(dá)的菌體，重懸于裂解液中，按照上述方法超聲破碎，收集上清。以緩沖液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH值為8.0)平衡Ni-NTA親和層析柱后，將上清置于層析柱中使目的蛋白與柱子充分結(jié)合；再以含有終濃度為50 mmol/L咪唑的緩沖液充分清洗層析柱；最后，以含有終濃度為200 mmol/L咪唑的緩沖液對(duì)Sumo-Capc蛋白進(jìn)行洗脫；之后通過(guò)SDS-PAGE和Western blot(抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體為一抗)對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定。洗脫蛋白經(jīng)無(wú)咪唑緩沖液透析去除咪唑后，按照Sumo蛋白酶說(shuō)明書(shū)對(duì)純化蛋白進(jìn)行酶切以去除Sumo標(biāo)簽；之后，利用SDS-PAGE對(duì)酶切后的目的蛋白進(jìn)行鑒定，并以鼠源PCV2 Cap單克隆抗體為一抗和HRP標(biāo)記羊抗鼠為二抗對(duì)目的蛋白的免疫反應(yīng)性進(jìn)行Western blot鑒定。

1.5 PCV2 VLP動(dòng)態(tài)光散射鑒定及電鏡觀察

對(duì)純化后的Capc蛋白進(jìn)行物理特性鑒定，利用動(dòng)態(tài)光散射對(duì)純化后的Capc蛋白的水化半徑進(jìn)行分析。另外，取微量純化后的Capc蛋白，將其緩慢滴于銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min后用濾紙從液滴邊緣將多余液體吸?。煌瑯尤∥⒘縫H值為7.0的磷鎢酸染液，滴于膜上染色約1 min，濾紙移去多余染液，干燥后透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體PE-Sumo-Capc構(gòu)建及鑒定

將重組Capc片段插入PE-Sumo載體中BsaⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)之間，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，利用引物Capc-F和Capc-R對(duì)挑取的克隆進(jìn)行PCR鑒定。2%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約747 bp處出現(xiàn)明顯條帶，符合預(yù)期大小(圖1)。將鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果正確。

2.2 重組Sumo-Capc蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化和可溶性分析

將重組表達(dá)質(zhì)粒PE-Sumo-Capc轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，對(duì)重組蛋白Sumo-Capc的最適表達(dá)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。收獲的菌體經(jīng)超聲破碎分離上清及沉淀后，SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，在約48 ku處有明顯的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期的重組蛋白Sumo-Capc大小相符，證明目的蛋白表達(dá)量較高；經(jīng)過(guò)優(yōu)化，目的蛋白在26 ℃時(shí)能夠以可溶形式表達(dá)于上清中，并且表達(dá)量相比其他溫度較高，大腸桿菌本體雜蛋白表達(dá)量較低；時(shí)間優(yōu)化結(jié)果顯示，在26 ℃下表達(dá)12 h后，目的蛋白表達(dá)量不再增加(圖2、3)。因此，重組Sumo-Capc蛋白最適表達(dá)條件確定為26 ℃誘導(dǎo)12 h。

M：蛋白質(zhì)Marker；1、2分別為誘導(dǎo)8 h后的上清和沉淀；3、4分別為誘導(dǎo)10 h后的上清和沉淀；5、6分別為誘導(dǎo)12 h后的上清和沉淀；7、8分別為誘導(dǎo)14 h后的上清和沉淀；9、10分別為誘導(dǎo)16 h后的上清和沉淀M:Protein Marker;1,2 represent supernatant and precipitate induced at 8 h,respectively;3,4 represent supernatant and precipitate induced at 10 h,respectively;5,6 represent supernatant and precipitate induced at 12 h,respectively;7,8 represent supernatant and precipitate induced at 14 h,respectively;9,10 represent supernatant and precipitate induced at 16 h,respectively圖3 26 ℃下重組Sumo-Capc蛋白表達(dá)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Results of expression time optimization of recombinant Sumo-Capc protein at 26 ℃

2.3 重組Sumo-Capc蛋白的純化、酶切和Western blot鑒定

SDS-PAGE和Western blot(抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體為一抗)結(jié)果顯示，超聲破碎后上清經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化后,能夠得到較純的帶有Sumo標(biāo)簽的目的蛋白(圖4)。以Sumo蛋白酶對(duì)Sumo-Capc蛋白進(jìn)行酶切去標(biāo)簽，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約27 ku處顯示明顯條帶，與預(yù)期的Capc蛋白大小一致(圖5A)；Western blot結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)能夠與鼠源PCV2 Cap單克隆抗體產(chǎn)生反應(yīng)，證明純化后的Capc蛋白具有針對(duì)PCV2 Cap單克隆抗體的免疫反應(yīng)性(圖5B)。

2.4 PCV2病毒樣顆粒物理特性鑒定

從圖6可看出，純化后的Capc蛋白形成了均一的、直徑為17～19 nm的蛋白質(zhì)聚集體。進(jìn)一步透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，純化后的Capc蛋白能夠自組裝形成直徑為17～19 nm的病毒樣顆粒(圖7)。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：裂解液上清；2：上樣流穿液；3：洗雜液；4：純化的Sumo-Capc蛋白M:Protein Marker;1:Supernatant after sonication;2:Flow fluid after sample loading;3:Wash flow fluid;4:Purified Sumo-Capc protein圖4 純化重組Sumo-Capc蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified recombinant Sumo-Capc protein

3 結(jié)論與討論

PCV2是引起一系列包括PCV2系統(tǒng)性疾病、PCV2亞臨床感染、呼吸性疾病、豬皮炎/腎病綜合征等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVD)的主要病原體，對(duì)世界范圍內(nèi)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅[17]。此外，該病毒具有變異快、傳播廣、毒力強(qiáng)、難清除等特點(diǎn)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為制約我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[7,18]。

疫苗免疫是預(yù)防PCVD的主要手段，免疫后能夠有效控制PCV2感染和PCVD相關(guān)疾病暴發(fā)[19]。目前，市場(chǎng)上針對(duì)PCV2的疫苗多為滅活疫苗和亞單位疫苗，并且大多數(shù)是基于PCV2a型毒株研發(fā)[19]。GenBank數(shù)據(jù)顯示，PCV2a型毒株在2003年以前是全球主要流行毒株，之后主要流行毒株變成了PCV2b型[20]，而PCV2b毒株感染也成為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨的重要問(wèn)題。與現(xiàn)有PCV2a的疫苗相比，基于PCV2b研發(fā)的疫苗能夠?yàn)閯?dòng)物提供更好的保護(hù)[21]。另外，由于PCV2當(dāng)前并不能完全從豬場(chǎng)清除[19]，針對(duì)當(dāng)前流行的毒株不斷提高現(xiàn)有疫苗效力成為PCV2疫苗研發(fā)的主要方向。因此，本試驗(yàn)以研究基于PCV2b亞型的亞單位疫苗為目的，以期為控制PCV2感染提供更為高效的疫苗候選。

A.Sumo-Capc蛋白的酶切結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化的Sumo-Capc；2：酶切后的Capc)；B.純化Capc蛋白的 Western blot 鑒定結(jié)果(M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化的Capc)A.Enzyme digestion of Sumo-Capc(M:Protein Marker;1:Purified Sumo-Capc;2:Capc after enzyme digestion);B.Western blot analysis of purified Capc (M:Protein Marker;1:Purified Capc)圖5 Sumo-Capc蛋白的酶切和純化Capc蛋白鑒定Fig.5 Enzyme digestion of Sumo-Capc protein and identification of purified Capc protein

圖6 重組Capc蛋白的動(dòng)態(tài)光散射分析Fig.6 Dynamic light scattering analysis of recombinant Capc protein

病毒樣顆粒具有與天然病毒形態(tài)完全一致的結(jié)構(gòu)，由于缺乏DNA或RNA等遺傳物質(zhì)不具有感染性，并能夠同時(shí)激活B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效保護(hù)靶動(dòng)物[22-23]。本研究以PCV2b型毒株Cap基因序列為對(duì)象，針對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)PCR將PCV2病毒中和表位226LKDPPLNP233構(gòu)建于Cap基因C端，將重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌后，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化，成功得到連接有自身中和表位的嵌合PCV2b病毒樣顆粒。重組蛋白Sumo-Capc的最適表達(dá)條件為26 ℃下誘導(dǎo) 12 h，該條件下目的蛋白容易富集并且具有較少的背景蛋白。Western blot鑒定結(jié)果顯示，純化后的目的蛋白Capc能夠與PCV2單克隆抗體產(chǎn)生特異的反應(yīng)，初步證明該蛋白質(zhì)具有針對(duì)PCV2 Cap蛋白的免疫反應(yīng)性。動(dòng)態(tài)光散射和透射電鏡分析結(jié)果顯示，目的蛋白形成了直徑為17～19 nm的病毒樣顆粒,與前人研究結(jié)果相符[24-25]。可見(jiàn)，在Cap蛋白C端插入同源中和表位片段對(duì)Cap病毒樣顆粒的形成能力沒(méi)有造成影響。前人研究也發(fā)現(xiàn)，插入合適長(zhǎng)度的異源表位對(duì)PCV2病毒樣顆粒的形成無(wú)影響[22]。本試驗(yàn)得到的病毒樣顆粒粒徑并不均一，可能與插入表位的長(zhǎng)度和理化特性有關(guān)。因而，Cap蛋白C端連接不同長(zhǎng)度或具有不同理化特性的插入片段對(duì)PCV2病毒樣顆粒形成大小的影響需要進(jìn)一步研究。

圖7 電鏡觀察Capc蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒 Fig.7 Transmission electron micrograph of viruslike particles by Capc protein self-assembly

綜上，本試驗(yàn)成功表達(dá)了串聯(lián)PCV2b中和表位的嵌合Capc蛋白，該蛋白質(zhì)能夠與PCV2單克隆抗體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)性，并能夠形成病毒樣顆粒，為后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，為PCV2相關(guān)疫苗的研究提供新的思路。