龐發(fā)虎,徐 鴿,李 敏，謝涵珠，陳兆進(jìn)

(1.南陽師范學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2.南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 南陽 473061)

發(fā)展可再生能源取代化石能源成為全球共識(shí)，其中,生物質(zhì)能源是可再生能源的重要組成。芒草(Miscanthus)作為第二代能源植物的代表，因其生物量大、纖維素含量高、適應(yīng)性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前最具開發(fā)潛力的高產(chǎn)纖維類能源植物之一，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-4]。土壤和植物體內(nèi)存在大量的細(xì)菌，能通過溶磷、固氮等途徑改善植物營(yíng)養(yǎng)以及分泌植物激素、鐵載體、特異性酶(ACC脫氨酶等)促進(jìn)植物在逆境條件下的生長(zhǎng)，在植物的生長(zhǎng)中起到重要作用[5-7]。因此，開展能源植物不同生境中細(xì)菌群落組成，特別是具有促生功能的細(xì)菌功能研究具有重要意義[8-9]。FARRAR等[8]系統(tǒng)總結(jié)了芒草、甘蔗、楊樹等能源植物內(nèi)生細(xì)菌組成，并指出有效利用植物與有益微生物之間的良好關(guān)系，為能源植物在各種生境中的生長(zhǎng)提供幫助。關(guān)于芒草根際和內(nèi)生細(xì)菌群落組成和功能研究已有開展，COPE-SELBY等[10]對(duì)芒草根際、根部、莖部、葉部和種子可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其由β、γ變形菌門和厚壁菌門3個(gè)門、5個(gè)科組成，表現(xiàn)出群落組成的豐富性。目前，研究者已從芒草根際、內(nèi)部分離篩選了細(xì)菌資源，包括Bacillusbarbaricus、Lysinibacillusfusiformis、Serratiasp.、Pseudomonassp.等[10]，及PseudomonaskoreensisAGB-1[11]、Azospirillumlipoferum、Herbaspirillum[12]、Azospirillumdoereineraesp.nov.GSF71[13]、HerbaspirillumfrisingenseGSF30[14]、Clostridiumspp.[15]，這些研究結(jié)果探明了不同生境中芒草細(xì)菌群落組成，并為后續(xù)研究促生細(xì)菌促進(jìn)芒草生長(zhǎng)提供了菌種資源[16]。

我國(guó)是世界芒草資源分布中心，全世界芒屬植物有14種，中國(guó)有7種，并且還有許多不同的變種、生態(tài)型和基因型，種質(zhì)資源極為豐富[1]。但目前我國(guó)不同生境中芒草細(xì)菌群落組成研究鮮見報(bào)道，限制了有益微生物輔助芒草生長(zhǎng)技術(shù)的應(yīng)用，相關(guān)工作亟待開展。因此，本研究采用傳統(tǒng)平板分離方法分離篩選、鑒定芒草根際和根部、莖部、葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成，并對(duì)其植物促生特性進(jìn)行測(cè)定，以期探明芒草根際、內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，初步分析其功能，并篩選到具有良好促生效果的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 供試材料

芒草于2013年5月種植于河南省南陽國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)能源植物栽培示范基地(坐標(biāo)為32°56′45.34″N和112°24′56.28″E)，本試驗(yàn)于2017年5月15日采集植物，采用抖落法收集根際土壤，芒草植株和收集的土壤樣品分別置于滅菌信封內(nèi)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 根際和內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌分離純化

采用有氮培養(yǎng)基(YN培養(yǎng)基)[17]和R2A培養(yǎng)基[18]分離芒草根際和內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌，具體過程：根際細(xì)菌分離采用稀釋梯度平板法，將1.0 g根際土壤加入100 mL無菌水中，稀釋到合適梯度，取100 μL涂布于YN和R2A培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，平板上生長(zhǎng)的為可培養(yǎng)根際細(xì)菌。芒草內(nèi)生菌分離參考文獻(xiàn)[19]的方法，先將芒草分為根部、莖部和葉部，分別稱取9、12、5 g組織，用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉各消毒5 min，用無菌水洗滌數(shù)遍后置于滅菌研缽中研磨至勻漿，加30 mL磷酸鈉緩沖液稀釋，取100 μL涂布于YN和R2A培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小分別挑取不同細(xì)菌，并在相應(yīng)平板上劃線純化，純化后的細(xì)菌用含25%甘油的培養(yǎng)基于-20 ℃保存，備用。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將菌株接種于分離時(shí)對(duì)應(yīng)的YN和R2A培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)18 h后取菌液于離心管中，12 000 r/min離心收集菌體后參考文獻(xiàn)[19]的方法提取細(xì)菌基因組DNA。采用通用引物27F和1492R對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[19]的方法，將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud網(wǎng)站(https://www.ezbiocloud.net)模式菌株的16S rRNA基因序列相比對(duì)，判定菌株所屬類群。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，下載相近的模式菌株序列，經(jīng)Clustal X對(duì)齊后，通過軟件MEGA 7(方法為Neighbour-Joining，Bootstrap值取1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 促生特性分析

根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，挑選不同種的細(xì)菌進(jìn)行促生特性分析，分別測(cè)定菌株產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力、產(chǎn)精氨酸脫羧酶(ADC)能力以及溶解難溶性磷酸鹽能力。菌株產(chǎn)IAA能力采用Salkowski顯色法進(jìn)行測(cè)定，產(chǎn)ADC能力采用平板顯色法進(jìn)行測(cè)定，具體步驟參考文獻(xiàn)[20]。溶磷試驗(yàn)采用鉬銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液中有效磷含量，具體步驟參考文獻(xiàn)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒草根際細(xì)菌群落組成

對(duì)于平板上生長(zhǎng)的根際細(xì)菌，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小分別挑取不同菌株，經(jīng)純化、保藏最終從YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到13株菌，共計(jì)26株根際細(xì)菌。對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列測(cè)定后與EzBioCloud網(wǎng)站中模式菌株進(jìn)行比對(duì)，確定其分類學(xué)地位，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，根際細(xì)菌分布于放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)4個(gè)門，放線菌綱(Actinobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和α-、β-、γ-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria)6個(gè)綱，短小桿菌屬(Curtobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等12個(gè)屬(表1)。其中，屬于芽孢桿菌屬的菌株數(shù)為8株、根瘤菌屬4株、短小桿菌屬3株，占根際細(xì)菌總數(shù)比例分別為30.77%、15.38%和11.54%，為其優(yōu)勢(shì)種群。

表1 芒草根際、內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌組成Tab 1 Cultivable rhizosphere and endophytic bacteria isolated from Miscanthus

注：表格中不同植物部位對(duì)應(yīng)數(shù)字為菌株數(shù)量。
Note:The number corresponding to different plant parts in the table represents the number of strains.

本試驗(yàn)通過YN和R2A培養(yǎng)基分離根際細(xì)菌，對(duì)其組成差異進(jìn)行分析，結(jié)果如下：YN和R2A培養(yǎng)基各分離到根際細(xì)菌13株，均分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門，放線菌綱、黃桿菌綱、芽孢桿菌綱等6個(gè)綱。在屬的水平上，YN培養(yǎng)基分離的菌株分布于短小桿菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬等6個(gè)屬，其中，芽孢桿菌屬、短小桿菌屬、根瘤菌屬菌株數(shù)分別為4、3、3株，為優(yōu)勢(shì)種群；R2A培養(yǎng)基分離的菌株分布于芽孢桿菌屬、劍菌屬(Ensifer)、根瘤菌屬等8個(gè)屬，其中，芽孢桿菌屬、劍菌屬菌株數(shù)分別為4、2株，為優(yōu)勢(shì)種群(表1)。分離到的12個(gè)屬的細(xì)菌經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，YN培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基共有的屬只有芽孢桿菌屬和根瘤菌屬。芽孢桿菌屬在2種培養(yǎng)基中菌株數(shù)量均為4株，但后續(xù)通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，YN培養(yǎng)基中與B.acidicelerCBD 119(1株)、B.altitudinis41KF2b(1株)、B.safensisFO-36b(1株)、B.tequilensisKCTC 13622(1株)相似性最高，R2A培養(yǎng)基中與B.aryabhattaiB8W22(1株)、B.megateriumNBRC 15308(3株)相似性最高。

2.2 芒草內(nèi)生細(xì)菌群落組成

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到13株和12株，共計(jì)25株根部?jī)?nèi)生細(xì)菌(表1)。對(duì)其分類學(xué)地位進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌類似，分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門、6個(gè)綱，短小桿菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等9個(gè)屬(表1)。其中，屬于短小桿菌屬的菌株數(shù)為5株、伯克霍爾德菌屬5株、根瘤菌屬4株，占根部?jī)?nèi)生細(xì)菌總數(shù)比例分別為20.00%、20.00%、16.00%，為其優(yōu)勢(shì)種群。同時(shí)對(duì)不同培養(yǎng)基根部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，YN培養(yǎng)基分離的細(xì)菌分布于2個(gè)門、4個(gè)綱、4個(gè)屬，其中伯克霍爾德菌屬(5株)、假單胞菌屬(3株)為獨(dú)有種群；R2A培養(yǎng)基分離的細(xì)菌分布于4個(gè)門、6個(gè)綱、7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬(3株)、草螺菌屬(Herbaspirillum，2株)、黃單胞菌屬(Xanthomonas，1株)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1株)和細(xì)小桿菌屬(Microbacterium，1株)為獨(dú)有種群；短小桿菌屬和根瘤菌屬為2種培養(yǎng)基共有種群(表1)。

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到7株和15株，共計(jì)22株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌(表1)。這些細(xì)菌分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門，放線菌綱、芽孢桿菌綱、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)等5個(gè)綱，短小桿菌屬、細(xì)小桿菌屬、Mucilaginibacter、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、水棲菌屬(Enhydrobacter)等9個(gè)屬(表1)。其中，屬于短小桿菌屬菌株數(shù)為8株、鞘脂單胞菌屬4株、Mucilaginibacter3株，占莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌總數(shù)比例分別為36.36%、18.18%和13.64%，為其優(yōu)勢(shì)種群。同時(shí)對(duì)不同培養(yǎng)基莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，YN培養(yǎng)基分離的細(xì)菌分布于2個(gè)門、3個(gè)綱、3個(gè)屬，沙雷氏菌屬(Serratia，1株)為獨(dú)有種群；R2A培養(yǎng)基分離的細(xì)菌分布于4個(gè)門、5個(gè)綱、8個(gè)屬，其中Mucilaginibacter(3株)、芽孢桿菌屬(2株)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，1株)等6個(gè)屬為獨(dú)有種群；短小桿菌屬和鞘脂單胞菌屬為2種培養(yǎng)基共有種群，菌株數(shù)均為4株和2株。根據(jù)KIM等[22]的方法將16S rRNA基因序列相似度98.65%作為種間的臨界值，對(duì)芒草細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，莖部分離的菌株13和14與已發(fā)表的模式種16S rRNA基因序列最大相似度分別為97.36%～98.70%和97.23%～97.78%，可能為潛在的新種(表2)。后續(xù)試驗(yàn)中，菌株14與參比菌株之間的平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity，ANI)介于78.5%～78.7%，基于基因組數(shù)據(jù)計(jì)算所得的DNA雜交同源率(In silico DNA-DNA hybridization，In silico DDH)介于22.2%～22.6%，低于相應(yīng)的閾值，結(jié)合生理生化特性等表型特征和化學(xué)組分分析，判定其為Pedobacter屬的1個(gè)新種，命名為Pedobactermiscanthisp.nov.[23]。與之類似，菌株13經(jīng)過分子鑒定、生理生化特性和化學(xué)組分分析，判定其為Mucilaginibacter屬的1個(gè)新種，命名為Mucilaginibacterendophyticussp.nov.[24]。

表2 篩選的44種細(xì)菌群落組成及其植物促生特性Tab 2 Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

續(xù)表2 篩選的44種細(xì)菌群落組成及其植物促生特性Tab 2(Continued) Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

續(xù)表2 篩選的44種細(xì)菌群落組成及其植物促生特性Tab 2(Continued) Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

注：表格中不同植物部位對(duì)應(yīng)數(shù)字為菌株數(shù)量；+為產(chǎn)ADC，-為不產(chǎn)ADC。
Note:The number corresponding to different plant parts in the table represents the number of strains,+ means production of ADC,- means no production of ADC.

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到8株和5株，共計(jì)13株葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌(表1)。這些細(xì)菌分布于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門3個(gè)門，放線菌綱、芽孢桿菌綱和α-變形桿菌綱3個(gè)綱，短小桿菌屬、芽孢桿菌屬和鞘脂單胞菌屬3個(gè)屬，群落組成較為單一。其中短小桿菌屬菌株數(shù)為9株，占葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌總數(shù)比例為69.2%，為其優(yōu)勢(shì)種群。芽孢桿菌屬和鞘脂單胞菌屬菌株數(shù)均為2株。同時(shí)對(duì)不同培養(yǎng)基葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，YN培養(yǎng)基分離的細(xì)菌組成單一，均屬于放線菌門的短小桿菌屬，經(jīng)后續(xù)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其分別與C.albidumDSM 20512(2株)、C.citreumDSM 20528(2株)、C.oceanosedimentumATCC 31317(4株)相似性最高；R2A培養(yǎng)基分離的細(xì)菌分布于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門3個(gè)門的3個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬(2株)和鞘脂單胞菌(2株)為獨(dú)有種群。

2.3 芒草根際、內(nèi)生細(xì)菌促生特性分析

在進(jìn)行菌株分離時(shí)，同一菌株可能被重復(fù)挑選，之前的研究多采用16S rRNA基因限制性酶切多態(tài)性分析其組成，挑取代表菌株進(jìn)行序列測(cè)定，準(zhǔn)確度有限[21]。因此，本試驗(yàn)將全部分離的86株菌進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud網(wǎng)站模式菌株相比對(duì)，EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中最高相似度種一致的菌株，結(jié)合菌落顏色、形態(tài)、大小等特征分析，認(rèn)定為同一菌株。根據(jù)分析篩選出44種細(xì)菌(圖1)，繼而對(duì)這44種細(xì)菌進(jìn)行促生潛在性評(píng)價(jià)(表2)。根際細(xì)菌根據(jù)序列比對(duì)，分布于20個(gè)種，其產(chǎn)IAA能力介于0.80～22.28 mg/L，其中產(chǎn)量超過10.00 mg/L的菌株占總數(shù)的61.54%；能產(chǎn)ADC的菌株9種，占菌株總數(shù)的34.62%；溶磷能力介于15.94～203.57 mg/L，其中超過100.00 mg/L的菌株占總數(shù)的46.15%。對(duì)不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，YN培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢(shì)菌株29(最高相似性種RhizobiumradiobacterATCC 19358T)和菌株3(CurtobacteriumoceanosedimentumATCC 31317T)具有良好的溶磷能力，分別為203.57、131.60 mg/L，菌株41(BacillustequilensisKCTC 13622T)和菌株22(PseudomonashunanensisLVT)同時(shí)具有較好的產(chǎn)IAA、ADC和溶磷能力；R2A培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢(shì)菌株40(BacillusmegateriumNBRC 15308T)具有較高產(chǎn)IAA能力，菌株31(EnsiferadhaerensCasida AT)具有良好產(chǎn)IAA能力和溶磷能力，分別為10.03、113.61 mg/L。25株根部?jī)?nèi)生細(xì)菌分布于14個(gè)種，其產(chǎn)IAA能力介于2.11～44.08 mg/L，其中產(chǎn)量超過10.00 mg/L菌株占總數(shù)的48.00%；能產(chǎn)ADC的菌株9種，占菌株總數(shù)的36.00%；溶磷能力介于23.65～203.57 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數(shù)的52.00%。對(duì)不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，具有良好促生能力的菌株多屬于YN培養(yǎng)基分離的菌株，如菌株15(BurkholderiagladioliNBRC 13700T)和菌株20(PseudomonaspsychrotoleransDSM 15758T)能產(chǎn)ADC，同時(shí)具有較強(qiáng)的溶磷能力；菌株21(PseudomonassimiaeOLiT)同時(shí)具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力和溶磷能力，菌株1(CurtobacteriumcitreumDSM20528T)同時(shí)具有3種促生特性(表2)。22株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌分布于17個(gè)種，其產(chǎn)IAA能力介于0.11～28.56 mg/L，其中產(chǎn)量超過10.00 mg/L菌株占總數(shù)的38.89%；能產(chǎn)ADC的菌株9種，占菌株總數(shù)的66.67%；溶磷能力介于23.65～175.30 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數(shù)的54.55%。對(duì)不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，具有良好產(chǎn)IAA能力的菌株主要分離自R2A培養(yǎng)基，YN培養(yǎng)基分離優(yōu)勢(shì)菌株3具有良好的溶磷能力。菌株24(SerratiamarcescensATCC 13880T)、菌株44(StaphylococcushaemolyticusMTCC 3383T)和菌株1同時(shí)具有3種促生特性(表2)。13株葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌分布于6個(gè)種，其產(chǎn)IAA能力介于8.31～22.28 mg/L，其中產(chǎn)量超過10.00 mg/L菌株占總數(shù)的53.85%；能產(chǎn)ADC的菌株8株，占菌株總數(shù)的61.54%；溶磷能力介于59.63～131.60 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數(shù)的53.85%。對(duì)不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，YN培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢(shì)菌株3(CurtobacteriumoceanosedimentumATCC 31317T)具有良好的溶磷能力，R2A培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢(shì)菌株36(SphingomonaspaucimobilisNBRC 13935T)具有產(chǎn)ADC能力(表2)。

圖1 基于可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the culturable bacteria constructed by the Neighbor-Joining method based on the 16S rRNA gene sequences

3 結(jié)論與討論

微生物在植物生長(zhǎng)過程中起到重要作用，因此開展植物根際土壤、內(nèi)生細(xì)菌群落組成研究具有重要意義[25]。目前關(guān)于芒草根際土壤和內(nèi)生細(xì)菌群落組成研究開展較少，特別是針對(duì)國(guó)內(nèi)生境中芒草細(xì)菌群落研究鮮見報(bào)道。筆者之前采用16S rDNA Miseq高通量測(cè)序技術(shù)的方法研究了芒草根際細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)其主要由變形菌門、擬桿菌門、放線菌門等31個(gè)門、343個(gè)屬的細(xì)菌組成，表現(xiàn)出群落組成的豐富性[26]。純培養(yǎng)菌株的獲得是微生物資源開發(fā)利用的重要前提和關(guān)鍵因素，因此本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)平板分離方法對(duì)種植5 a的芒草根際細(xì)菌和不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行研究。結(jié)果表明，根際細(xì)菌由放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門、6個(gè)綱、12個(gè)屬的細(xì)菌組成，與高通量測(cè)序結(jié)果相比群落組成較為單一，絕大多數(shù)細(xì)菌同時(shí)出現(xiàn)在可培養(yǎng)和高通量測(cè)序結(jié)果中，但節(jié)桿菌屬、劍菌屬和Pseudoduganella只出現(xiàn)在可培養(yǎng)結(jié)果中，推測(cè)這些菌株在土壤中占比較低，通過培養(yǎng)基富集培養(yǎng)從而被分離出來。該結(jié)果與COPE-SELBY等[10]關(guān)于芒草根際可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成研究類似，芽孢桿菌屬均為優(yōu)勢(shì)種群。從芒草根部、莖部和葉部共分離60株內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)其群落分析表明，由放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門、7個(gè)綱、15個(gè)屬的細(xì)菌組成，其中短小桿菌屬在根、莖、葉中占比分別為20.00%、36.36%、69.23%，為內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群，同時(shí)伯克霍爾德菌屬為根部?jī)?yōu)勢(shì)種群，鞘脂單胞菌屬為莖部?jī)?yōu)勢(shì)種群，這些菌株也廣泛存在于水稻等植物體內(nèi)[27-28]，但因芒草品種和土壤等外界環(huán)境不同，與COPE-SELBY等[10]關(guān)于芒草內(nèi)生細(xì)菌群落組成研究有所差異。對(duì)比根際和內(nèi)生細(xì)菌群落可以發(fā)現(xiàn)，根際優(yōu)勢(shì)種群短小桿菌屬存在于根部、莖部和葉部，且同時(shí)為其優(yōu)勢(shì)種群。與此類似，土壤優(yōu)勢(shì)種群芽孢桿菌屬菌株廣泛存在于芒草不同組織內(nèi)部。以上結(jié)果與內(nèi)生細(xì)菌來源于土壤等外界環(huán)境，進(jìn)入植物體內(nèi)定殖和適度繁殖的觀點(diǎn)相一致[29]。同時(shí)根部?jī)?yōu)勢(shì)種群伯克霍爾德菌屬、莖部?jī)?yōu)勢(shì)種群Mucilaginibacter和葉部的黃桿菌屬等只出現(xiàn)在相應(yīng)的組織中，其中，菌株13、14只存在于芒草莖部，經(jīng)分子鑒定、生理生化特性和化學(xué)組分分析，判定其為2個(gè)新種，分別命名為Mucilaginibacterendophyticussp.nov.[24]和Pedobactermiscanthisp.nov.[23]，表現(xiàn)出不同組織群落組成的差異。同時(shí)不同培養(yǎng)基因其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分、離子含量等條件的差異，導(dǎo)致對(duì)微生物具有不同的選擇性。對(duì)YN和R2A 2種培養(yǎng)基分離菌株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其群落組成互相補(bǔ)充，因此，后續(xù)研究時(shí)應(yīng)考慮培養(yǎng)基種類及其組合以獲得盡可能全面的芒草細(xì)菌群落組成[30]。

TIMMUSK等[31]研究表明，具有促生特性功能的可培養(yǎng)細(xì)菌在植物生長(zhǎng)中起到重要的作用。植物促生細(xì)菌PseudomonaskoreensisAGB-1分離自芒草根部，芒草接種試驗(yàn)表明其能提高芒草生物量和重金屬積累量[11]。本試驗(yàn)對(duì)芒草根際和內(nèi)生細(xì)菌促生特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)很多菌株具有良好的促生特性。其中產(chǎn)IAA能力超過10.00 mg/L的菌株數(shù)為42株，占菌株總數(shù)的48.84%；產(chǎn)ADC的菌株36株，占菌株總數(shù)的41.86%；溶磷能力超過100.00 mg/L的菌株44株，占菌株總數(shù)的51.16%。這些菌株分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個(gè)門，7個(gè)綱，21個(gè)屬，其中短小桿菌屬、根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、鞘脂單胞菌屬為其主要組成，該結(jié)果與之前的關(guān)于促生細(xì)菌群落組成研究類似[32-34]。其中菌株29(RhizobiumradiobacterATCC 19358T)、菌株21(PseudomonassimiaeOLiT)、菌株22(PseudomonashunanensisLVT)、菌株44(StaphylococcushaemolyticusMTCC 3383T)等同時(shí)具有3種促生特性，是后續(xù)用于研究提高芒草生長(zhǎng)能力的良好菌種資源。細(xì)菌組成和促生能力分析表明，不同部位之間有所差異，根際細(xì)菌產(chǎn)ADC和溶磷能力較強(qiáng)菌株比例均低于內(nèi)生細(xì)菌，產(chǎn)IAA能力較強(qiáng)菌株比例低于葉部，高于根部和莖部?？梢?，植物組織內(nèi)部作為重要的促生細(xì)菌來源，在后續(xù)芒草促生細(xì)菌篩選過程中應(yīng)予以重視。