陳麗萍，閆占鵬，賴夢(mèng)書，陳 蕓，李 芳，呂廷保，范效英，劉 燕，丁元明**

（1.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南 昆明 650200；2.安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司，河南 鄭州 450001；3.河口海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，云南 河口 661300）

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種新興的高通量生物質(zhì)譜技術(shù)，具有高靈敏度、高通量、快速、準(zhǔn)確、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA/RNA、多糖等生物大分子的檢測(cè)，尤其是給臨床微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域及菌株耐藥性評(píng)定等領(lǐng)域帶來(lái)新的思路[1-4]。目前已將MALDI-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于大型食用菌甄別鑒定中，并確定液氮甲酸法為合適的前處理方法，得到云南香格里拉地區(qū)和四川稻城地區(qū)的松茸蛋白指紋圖譜[5]。至今，未見運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行云南出口高價(jià)值特色野生食用菌塊菌（Tuber indicum Cooke & Massee）、美味牛肝菌（Boletus bainiugan Dentinger）物種鑒定檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。

云南優(yōu)越的地理、氣候條件，孕育了豐富多樣的野生食用菌種類。全球已報(bào)道2 500余種野生食用菌，我國(guó)已知約1 000種，云南野生食用菌記載近900種，約占世界食用菌物種36%，全國(guó)的90%，因此，云南是當(dāng)之無(wú)愧的野生菌王國(guó)[6]。從產(chǎn)量和國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)份額看，云南野生食用菌的數(shù)量及產(chǎn)量均獨(dú)占鰲頭，風(fēng)味品質(zhì)首屈一指，每年均有大量著名且訂購(gòu)需求量巨大的野生食用菌類，如塊菌、美味牛肝菌等云南特色高價(jià)值野生食用菌從云南出口至歐美等地區(qū)[6-7]。野生食用菌出口是云南省重要的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易支柱產(chǎn)業(yè)，而隨著云南特色高價(jià)值野生食用菌知名度增加，國(guó)內(nèi)外營(yíng)銷渠道擴(kuò)寬，已有一些國(guó)家或地區(qū)要求出具野生食用菌物種甄別的官方證明。

美味牛肝菌、塊菌都是典型的共生菌，與樹木以及土壤中的微生物存在生態(tài)共生關(guān)系，人們無(wú)法將其從復(fù)雜的森林生態(tài)中剝離并單獨(dú)進(jìn)行栽培，人工促繁技術(shù)無(wú)法跟上目前的生產(chǎn)模式和商業(yè)需求[8-9]。因此，對(duì)野生食用菌無(wú)序、過(guò)度的開發(fā)現(xiàn)狀，將造成資源的嚴(yán)重破壞，甚至物種瀕臨滅絕[7,10]。物以稀為貴，在高額經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，野生食用菌貿(mào)易中易出現(xiàn)不良商販摻假、混雜、品種替代的情況。

塊菌、美味牛肝菌蛋白質(zhì)含量豐富，藥用價(jià)值高，長(zhǎng)期食用能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，具有抗腫瘤、抗突變、降血脂[11-13]等功效，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。且新鮮程度越高，其貿(mào)易價(jià)值越高，為了促進(jìn)野生食用菌產(chǎn)業(yè)貿(mào)易的良性發(fā)展，需要建立一種快速、高通量的物種甄別方法。通過(guò)運(yùn)用MALDITOF-MS技術(shù)，首次對(duì)塊菌和美味牛肝菌2種云南出口特色高價(jià)值野生食用菌進(jìn)行種類鑒別對(duì)比分析，為野生食用菌產(chǎn)業(yè)的貿(mào)易發(fā)展提供有利條件。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)儀器

Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司；sartorius 1-14離心機(jī)sigma公司；KQ-100KDE超聲波清洗器，昆山超聲儀器公司；微量移液器，Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；磷酸，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品、液氮，河南源正科技發(fā)展有限公司；甲酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，均為色譜純；α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)，美國(guó)Sigma公司；試驗(yàn)用水為ddH2O。

1.3 試驗(yàn)樣品及來(lái)源

真空凍干塊菌和真空凍干美味牛肝菌，共22份，由野生食用菌出口企業(yè)昆明春鸞商貿(mào)有限公司提供，并送昆明植物研究所進(jìn)行野生食用菌物種外觀和DNA條形碼檢測(cè)鑒定，確定其物種名見表1。

表1 樣本信息Tab.1 Sample information

1.4 MALDI-TOF-MS對(duì)野生食用菌的鑒定方法

1.4.1 蛋白提取方法

分別取15 mg塊菌和美味牛肝菌干品放入研缽中，加入適量液氮反應(yīng)（30±5）s，將塊菌和美味牛肝菌干品碾碎轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中；加入 60 μL的 70%甲酸溶液吹打混勻，加入等體積的乙腈，13 000 r·min-1離心 1 min，取上清[5]。

1.4.2 提取液蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

Bradford法測(cè)定溶液蛋白濃度是一種可靠、快速且敏感的檢測(cè)方法，考馬斯亮藍(lán)G-250試劑有藍(lán)紅2種不同顏色的形式，在一定的乙醇及酸性條件下會(huì)呈現(xiàn)淡紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595 nm紫外波長(zhǎng)出有特殊吸收峰，并且在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可據(jù)此推算蛋白質(zhì)溶液濃度[14]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：緩沖液按甲酸/乙腈配比1∶1配制；標(biāo)準(zhǔn)液為1 mg·mL-1牛血清白蛋白（BSA）溶液；工作液為將50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250試劑溶入25 mL無(wú)水乙醇中，加入50 mL的85%磷酸，定容至500 mL，使用前濾紙過(guò)濾沉淀，每次工作液加樣量均為3 mL。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣量見表2。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定不同提取液蛋白濃度。

表2 Bradford法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣信息表Tab.2 Bradford method to develop standard curve sample loading information table

1.4.3 質(zhì)譜條件

1）基質(zhì)溶液的配制。用V（2.5%三氟乙酸的超純水）∶V（乙腈）=1∶1混合制成的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)樣本分子量選擇的基質(zhì)HCCA溶解（1 mg·100-1mL-1）?；|(zhì)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）吸取1 μL經(jīng)1.4.1處理的食用菌蛋白提取液滴加到Anchorchip靶板上，干燥后滴加1 μL基質(zhì)溶液，待完全干燥后放入質(zhì)譜儀器中檢測(cè)。用安圖公司微生物鑒定校準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)儀器質(zhì)量準(zhǔn)確性校準(zhǔn)。

3）Autof ms1000儀器參數(shù)設(shè)定。推斥極電壓20 kV，激光頻率60 Hz，質(zhì)量范圍2 000 Da～20 000 Da，離子延時(shí)時(shí)間230 ns，激光強(qiáng)度35%[5]。

4）圖譜采集。用 Autof Acquirer軟件對(duì)樣品點(diǎn)進(jìn)行圖譜采集，每個(gè)樣品平行滴加3個(gè)靶位，每個(gè)靶位采集1張譜圖，每張圖累加3次，每次累加激光擊打40次。將不同菌株采集到的圖譜分類保存。

1.4.4 圖譜分析

用Autof Analyser軟件對(duì)不同菌株采集的圖譜進(jìn)行比對(duì)及聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

提取液蛋白質(zhì)濃度與吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度在0.01 mg·mL-1～0.09 mg·mL-1內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.807 5x+0.013 8，測(cè)得塊菌的提取液蛋白質(zhì)濃度為0.243 mg·mL-1，美味牛肝菌的提取液蛋白質(zhì)濃度為 0.284 mg·mL-1。

2.2 不同菌類蛋白指紋圖譜分析

由于真菌類蛋白指紋圖譜普遍基線強(qiáng)度較高，因此試驗(yàn)所有指紋圖譜均為除基線后的譜圖。真空凍干美味牛肝菌樣本譜圖見圖2。

從圖2可以看出，昆明市祿勸縣LN1～LN6樣品的主要特征峰質(zhì)荷比（m/z）分別為：2 682、3 411、4 664、7 041、7 064。楚雄州蒼嶺鎮(zhèn)美味牛肝菌樣本 CN1-CN6的譜圖特征峰質(zhì)荷比 （m/z）為：2 327、2 682、3 665、4 664、7 064。圖譜結(jié)果表明，樣本LN與樣本CN具有相同特征峰，其質(zhì)荷比（m/z）為：2 682、4 664、7 064。凍干塊菌譜圖見圖3。

從圖3可以看出，楚雄州蒼嶺鎮(zhèn)塊菌樣本特征峰質(zhì)荷比（m/z）為：4 078、4 118、9 850。攀枝花塊菌樣本譜圖特征峰質(zhì)荷比（m/z）為：4 078、4 118、6 113、9 850。凍干塊菌樣本CS與樣本PS具有相同的特征峰質(zhì)荷比為：4 078、4 118、9 850。

2.3 進(jìn)化關(guān)系分析

將樣本圖譜用Analyzer軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，樣本被歸為2大類，真空凍干美味牛肝菌昆明市祿勸縣（LN）與楚雄州蒼嶺鎮(zhèn)樣本（CN）歸為一大類；真空凍干塊菌楚雄州蒼嶺鎮(zhèn)樣本（CS）與攀枝花樣本（PS）被歸為一大類。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)研究樣本為2個(gè)產(chǎn)地的塊菌、2個(gè)產(chǎn)地的美味牛肝菌，共計(jì)22份，以盲樣編號(hào)方式將樣本送至鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司進(jìn)行鑒定。樣品通過(guò)聚類分析分為2類，與物種分類一致。同種菌類譜圖具有相同的特征峰，不同菌類譜圖間差異峰較大，說(shuō)明同種食用菌間具有較相似的蛋白質(zhì)組成，不同食用菌蛋白質(zhì)具有較大差異。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有多達(dá)150萬(wàn)真菌類物種，其種類及數(shù)量在自然界中僅次于昆蟲。真菌物種豐富多樣，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用，而且其蘊(yùn)含巨大的食用及藥用價(jià)值[15]。食用菌作為眾多真菌資源中的大型真菌，是云南各地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上重要的農(nóng)副產(chǎn)品，塊菌和美味牛肝菌是云南省出口創(chuàng)匯的主要品種[6-7]。塊菌有獨(dú)特的香氣，滋味極其鮮美，又具保健強(qiáng)身之功，被視為食用菌中的珍品，與鵝肝、魚子醬并稱為世界3大美味[16]。全球迄今共報(bào)道60余種塊菌，我國(guó)現(xiàn)報(bào)道26種，其中印度塊菌（Tuber indicum Cooke & Massee）為主要貿(mào)易食用菌，以出口為主[17]；美味牛肝菌經(jīng)現(xiàn)代研究證明，其所含的化學(xué)成分不僅有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂和提高人體免疫力等多種藥理作用[12]。

為了持續(xù)利用云南特色高值野生菌資源，更好的拓展貿(mào)易市場(chǎng)，需要對(duì)大宗出口的美味牛肝菌和塊菌進(jìn)行快速物種身份甄別。形態(tài)學(xué)鑒定依賴鑒定者的經(jīng)驗(yàn)，且對(duì)于外觀形態(tài)已發(fā)生改變的制品較難鑒定。

近年來(lái)，研究者們采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)真菌的分類鑒定展開了大量研究[18-20]，可運(yùn)用于野生食用菌菌制品，如菌塊、菌絲和菌干的物種鑒定，但該鑒定方法難以在短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，而MALDITOF-MS技術(shù)可在20 min內(nèi)完成食用菌物種鑒定，并可對(duì)大量野生食用菌實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)。

通過(guò)采集不同種屬及不同地域的食用菌，利用MALDI-TOF-MS技術(shù)收集特征指紋圖譜，構(gòu)建野生食用菌的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，可進(jìn)一步對(duì)未知的野生食用菌進(jìn)行分類鑒定，為誤食野生菌中毒食品安全事件的調(diào)查以及防控提供技術(shù)手段。