卜義明，江曉路，孟 菲，呂秀霞

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

蛹蟲草類胡蘿卜素是一種水溶性類胡蘿卜素，自 2013年Dong[1]從蛹蟲草（Cordyceps militaris）子實體中分離純化得到了4種水溶性的類胡蘿卜素（Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxanthin-Ⅱ、Cordyxanthin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ）以來，蛹蟲草類胡蘿卜素受到了科研人員的廣泛關(guān)注。類胡蘿卜素是無毒無害的天然著色劑，具有抗炎、抗氧化等功效[2]。然而絕大部分類胡蘿卜素為脂溶性，不易于人體吸收且對光熱不穩(wěn)定。為提高其相關(guān)產(chǎn)品的生物利用度，研究人員提出了采用乳化劑、納米凝膠、納米分散體系、微膠囊等多種應(yīng)對方法[3-6]，無形中增加了類胡蘿卜素的開發(fā)應(yīng)用成本。研究表明，蛹蟲草類胡蘿卜素作為水溶性胡蘿卜素，同樣具有較強的著色能力以及抗氧化、抑菌等功效[7-9]，并且理論上較脂溶性類胡蘿卜素具有更高的生物利用度。因此，蛹蟲草類胡蘿卜素在食品、醫(yī)藥、化妝品、紡織業(yè)等領(lǐng)域都具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

蛹蟲草類胡蘿卜素的主要提取方法有2種：一類是以丙酮為溶劑的酸熱法[10]，使用強酸高溫實現(xiàn)細胞破碎的同時很可能也破壞了類胡蘿卜素原有結(jié)構(gòu)，并且引入了有毒試劑，不利于食品級蛹蟲草類胡蘿卜素的開發(fā)。另一類是以一定濃度的乙醇水溶液為溶劑的直接浸提[1]或超聲輔助浸提法[11]，這兩種方法提取效率較低，超聲的使用也將增加生產(chǎn)成本，Dong[1]使用超聲輔助浸提法得到的蛹蟲草類胡蘿卜素含量為1 270 μg·g-1，小于張志軍[10]使用酸熱法得到蛹蟲草類胡蘿卜素含量（2 158 μg·g-1）。目前，蛹蟲草類胡蘿卜分離純化方法報道也較少，主要有硅膠柱層析法[12]和制備型液相色譜法[1]。硅膠柱層析需要反復(fù)多次才能達到較好的純化效果，純化效率較低；制備型液相色譜純化過程較多試劑消耗，成本較高；而且這兩種方法的操作比較復(fù)雜，不利于規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用。

為了開發(fā)一種成本低、效率高、條件溫和、操作簡便、節(jié)能環(huán)保的蛹蟲草類胡蘿卜素的分離純化方法，對蛹蟲草類胡蘿卜素的酶法提取及TLC純化進行了初步研究，以期為蛹蟲草類胡蘿卜素的進一步開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)參考與理論依據(jù)。

1 材料與儀器

蛹蟲草子實體：購自沈陽聚鑫生物有限公司；脂肪酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司；蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈，TLC薄層板：德國Merck公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

AR224CN型分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；L5S紫外可見分光光度計：上海精科儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀：Agilent公司；KQ5200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DFY-400粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司。

2 試驗方法

2.1 子實體粉制備及類胡蘿卜素吸收光譜繪制

將蛹蟲草子實體置于40℃鼓風干燥箱內(nèi)干燥至恒重，粉碎機粉碎，過60目篩，得子實體粉。

參考Dong[1]方法并做適當調(diào)整：準確稱取0.5 g蛹蟲草子實體粉，加入10 mL的80%乙醇充分混勻，于室溫下靜置 30 min，4 800 r·min-1離心 20 min，取上清液過0.22 μm微孔膜過濾并于400 nm～500 nm光譜掃描，繪制吸收光譜，得到最大吸收波長。

2.2 蛹蟲草類胡蘿卜素酶法提取研究

2.2.1 樣品酶解前處理的料液比篩選

準確稱取1.0 g蛹蟲草子實體粉，按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的料液比 （m∶v）加入蒸餾水，充分攪拌后，觀察樣品狀態(tài)。以流動性適中的料液比做為最佳料液比。

2.2.2 酶的篩選

根據(jù)Dong[1]得到的4種蛹蟲草類胡蘿卜素分子量（494.6～536.6）可知該色素為小分子。小分子進出細胞主要受細胞膜的脂雙層和膜轉(zhuǎn)運蛋白影響[13]。因此，選擇蛋白酶、脂肪酶作為試驗用酶，考慮到類胡蘿卜素分子多烯鏈結(jié)構(gòu)的極大不穩(wěn)定性，為減少pH對蛹蟲草類胡蘿卜素的影響，最終選定pH 6.0～8.5的6種酶，如表1所示。

表1 備選酶的最適pH和最適溫度Tab.1 Optimum pH and temperature of alternative enzymes

另設(shè)直接浸提組和超聲輔助提取組作為對照組。稱取1 g蛹蟲草子實體粉，按最佳料液比加入蒸餾水，渦旋混勻。對照組pH不變，將試驗組pH調(diào)至備選酶最適pH后，把對照組和試驗組置于50℃（酶的最適溫度）水浴中。待溫度恒定，加入0.01 g備選酶（蛹蟲草子實體粉干重的1%，確保酶足量），渦旋混勻，酶解1 h。與此同時，對照組分別于50℃下直接浸提和超聲輔助提取1 h。用無水乙醇將試驗組與對照組溶劑的乙醇含量調(diào)成50%[1]，渦旋混勻后在室溫下靜置1 h。以4 800 r·min-1離心10 min，取上清液測定在最大吸收波長處的吸光值，計算蛹蟲草類胡蘿卜素含量，選擇輔助提取得到蛹蟲草類胡蘿卜素含量較高的酶作為最佳酶。蛹蟲草類胡蘿卜素含量（P，μg·g-1）計算公式[10]如下：

式中：A：最大吸收波長處的吸光值；V：提取溶劑的體積（mL）；D：稀釋倍數(shù)；0.16：類胡蘿卜素的提取系數(shù)；W：蛹蟲草子實體干重（g）。

2.2.3 酶法提取工藝優(yōu)化

1）酶解時間平衡曲線

稱取1 g蛹蟲草子實體粉，按最佳料液比加入蒸餾水，渦旋混勻。將pH調(diào)至最佳酶的最適pH，置于50℃水浴中，待溫度恒定加入0.01 g最佳酶，渦旋混勻并開始計時，分別于0、15 min、30 min、45 min、60 min時迅速加入無水乙醇將溶劑的乙醇含量調(diào)成50%，渦旋混勻后在室溫下靜置1 h。以4 800 r·min-1離心10 min，取上清液測定在最大吸收波長處的吸光值，計算蛹蟲草類胡蘿卜素的含量。

2）溶劑的乙醇濃度對類胡蘿卜素含量的影響

稱取1 g蛹蟲草子實體粉，按最佳料液比加入蒸餾水，渦旋混勻。將pH調(diào)至最佳酶的最適pH，置于50℃水浴中，待溫度恒定加入0.01 g最佳酶，酶解到步驟1中得出的酶解平衡時間。迅速加入無水乙醇，分別將溶劑的乙醇含量調(diào)成30%、40%、50%、60%、70%，渦旋混勻后在室溫下靜置1 h。以4 800 r·min-1離心10 min，取上清液測定在最大吸收波長處的吸光值，計算蛹蟲草類胡蘿卜素的含量。

3）浸提時間平衡曲線

稱取1 g蛹蟲草子實體粉，按最佳料液比加入蒸餾水，渦旋混勻。將pH調(diào)至最佳酶的最適pH，置于50℃水浴中，待溫度恒定加入0.01 g最佳酶，酶解到步驟1中得出的酶解平衡時間。迅速加入無水乙醇，將溶劑的乙醇含量調(diào)至步驟2中得到的最佳百分比，渦旋混勻后，在室溫下分別靜置0、30 min、60 min、90 min、120 min，以 4 800 r·min-1離心10 min，取上清液測定在最大吸收波長處的吸光值，計算蛹蟲草類胡蘿卜素的含量。

2.3 蛹蟲草類胡蘿卜素TLC純化法的研究

2.3.1 蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液的制備

按優(yōu)化后的提取工藝制備1 000 mL蛹蟲草類胡蘿卜素粗提液，真空濃縮至200 mL，加3倍體積乙醇，充分攪拌后4 800 r·min-1離心10 min，收集上清液濃縮至100 mL得到濃縮液。

2.3.2 展開劑的選擇

參考唐克華[14]的方法，根據(jù)蛹蟲草類胡蘿卜素水溶性的特點以及Dong[1]的流動相配比，選擇冰乙酸、水、無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯來配制備選展開劑。取蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液在距薄層板下端邊緣1 cm處劃線，線長1 cm，線距1 cm，線數(shù)3條，每條上樣量10 μL，用備選展開劑分別展開，以條帶分離好、不拖尾、間隔均勻的展開劑為最佳展開劑。

2.3.3 蛹蟲草類胡蘿卜素TLC純化分析

取蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液在距薄層板下端邊緣1 cm處劃線，線長1 cm，線距1 cm，線數(shù)10條，每條上樣量10 μL，上樣總量為100 μL。用最佳展開劑展開，根據(jù)可見光下觀察到的展開結(jié)果，分別刮下薄板上同一Rf值的每個條帶，加入50%乙醇 300 μL，充分震蕩，10 000 r·min-1離心 5 min，編號收集各條帶的溶出液。參考Dong的HPLC方法[1]，用類胡蘿卜素濃縮液和收集到的各條帶溶出液進行HPLC對比分析。乙腈為溶劑A（0.5%乙酸為溶劑B），0～55 min，溶劑A含量40%～58%；55 min～60 min，溶劑A含量40%～58%；柱溫25℃，上樣量20 μL（上樣前過0.22 μm微孔膜過濾），流速1.0 mL·min-1，檢測波長為2.1中得到的最大吸收波長。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013分析，重復(fù)3次，使用SPSS 24通過單因素ANOVA分析數(shù)據(jù)并表示為平均值±標準差。P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為極顯著水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 光譜掃描結(jié)果

蛹蟲草類胡蘿卜素在400 nm～500 nm光譜掃描結(jié)果如圖1所示，檢測到最大吸收峰445 nm和2個肩峰420 nm和475 nm，是典型的類胡蘿卜素光譜[1，15]。

3.2 蛹蟲草類胡蘿卜素酶法提取

3.2.1 樣品酶解前處理的料液比選擇

蛹蟲草子實體粉按不同料液比加水后的狀態(tài)如表2所示。

表2 按不同料液比加水后的樣品狀態(tài)Tab.2 The state of the sample after adding water with different solid-liquid ratio

由表2可知，當料液比為1∶4時，蛹蟲草子實體粉被水完全浸潤，流動性適中，為酶解提供了適宜的液體環(huán)境。因此，選擇1∶4為樣品酶解前處理的最佳料液比。

3.2.2 酶的篩選

不同酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素含量見圖2。

如圖2所示，中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶以及脂肪酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素的含量均明顯高于（P＜0.05）直接浸提和超聲2個對照組，說明這4種酶能對蛹蟲草子實體細胞有很好的酶解作用，其中脂肪酶的類胡蘿卜素含量高出對照組最為顯著（P＜0.01）?？赡苁且驗樗苄缘挠枷x草類胡蘿卜素分子從胞內(nèi)釋放受細胞膜脂雙層的影響較大，所以蛹蟲草子實體經(jīng)脂肪酶降解后，類胡蘿卜素的釋放更充分。因此，脂肪酶為最佳酶。

3.2.3 酶法提取工藝優(yōu)化

1）酶解時間平衡曲線

不同酶解時間對蛹蟲草類胡蘿卜素提取含量影響見圖3。如圖3所示，用脂肪酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素，0～30 min蛹蟲草類胡蘿卜素含量逐漸升高，30 min時含量達到最大，之后隨著時間增加，含量不再有明顯變化。說明脂肪酶破碎細胞的效率很高，但時間內(nèi)就能明顯提升蛹蟲草類胡蘿卜素從胞內(nèi)釋放。30 min以后，酶解已達到平衡，為了節(jié)省時間，取30 min為最佳酶解時間。

2）溶劑的乙醇濃度對類胡蘿卜素含量的影響

試驗結(jié)果見圖4。

如圖4所示，乙醇濃度在30%～60%之間時，蛹蟲草類胡蘿卜素含量隨著乙醇濃度增加而增加，當乙醇濃度在60%時含量最大。當乙醇濃度達到70%時，蛹蟲草類胡蘿卜素含量迅速下降。可能是蛹蟲草類胡蘿卜素的極性最為接近60%乙醇水溶液的極性，溶解度最大。因此，選擇60%的乙醇作為溶劑的最佳乙醇濃度。

3）浸提時間平衡曲線

不同浸提時間對類胡蘿卜素含量影響見圖5。

如圖5所示，浸提時間在0～90 min范圍內(nèi)，蛹蟲草類胡蘿卜素含量隨著時間增加逐漸提高，在90 min時達到最大值。90 min以后，含量不再有顯著變化。說明90 min時，溶劑中的蛹蟲草類胡蘿卜素溶解度達到飽和。因此，選擇90 min為最佳浸提時間。在最佳酶解時間30 min，最佳溶劑乙醇濃度60%，最佳浸提時間90 min條件下，酶法提取蛹蟲草類胡蘿卜素的含量可達到（1 747.8±17.6）μg·g-1。

綜上，得到蛹蟲草類胡蘿卜素脂肪酶輔助提取最佳工藝為：蛹蟲草子實體粉與水1∶4(m∶v)混勻，加入0.1%脂肪酶，于pH 8.0～8.5，50℃條件下酶解30 min；于室溫下加入乙醇，將濃度調(diào)至60%，浸提90 min；離心收集上清液得到蛹蟲草類胡蘿卜素粗提液。該工藝的蛹蟲草類胡蘿卜素含量最高能達到 （1 747.8 ± 17.6）μg·g-1，顯著高于直接浸提[（652.3 ± 24.9）μg·g-1]和超聲輔助提取 [（661.5 ±41.9）μg·g-1]的蛹蟲草類胡蘿卜素含量 （P＜0.01）。

3.3 蛹蟲草類胡蘿卜素TLC純化

3.3.1 展開劑的選擇

蛹蟲草類胡蘿卜素在不同展開劑中分離的效果見表3。如表3所示，蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液用配比為0.5%乙酸水溶液∶乙醇∶正丁醇∶乙酸乙酯=12∶8∶24∶36的展開劑展開后，條帶分離效果好，間隔清晰，無拖尾。因此，選該配比為最佳展開劑。該配比也說明蛹蟲草類胡蘿卜素分子具有較強的極性。

3.3.2 蛹蟲草類胡蘿卜素TLC純化分析

蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液經(jīng)最佳展開劑在TLC板上展開結(jié)果見圖6。

由圖6可知，蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液TLC板上展開后，可以清晰地分離出4個條帶。TLC法純化蛹蟲草類胡蘿卜素的HPLC檢驗結(jié)果見圖7。

如圖7所示，經(jīng)HPLC對比分析，4個條帶溶出液的出峰的時間和順序分別與Dong[1]發(fā)現(xiàn)的Cordyxanthin-Ⅰ、Cordyxanthin-Ⅱ、Cordyxanthin-Ⅲ、Cordyxanthin-Ⅳ的出峰時間順序一一對應(yīng)，主峰的峰面積百分比分別為76.10%、95.90%、97.96%、81.53%。由此推測，分離得到的4個條帶可能是文獻報道的4種蛹蟲草類胡蘿卜素。為驗證這一推測還需借助質(zhì)譜核磁等儀器對其結(jié)構(gòu)進行解析，見圖8。

表3 蛹蟲草類胡蘿卜素在不同展開劑中分離的效果Tab.3 Separating effect of Cordyceps militaris carotenoids in different developing solvent

4 結(jié)論

經(jīng)過試驗對比，使用酶法提取蛹蟲草類胡蘿卜素，比使用直接浸提法和超聲輔助提取法效果更好，其中使用脂肪酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素的含量最高。通過單因素實驗，初步優(yōu)化了脂肪酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素的條件，該工藝條件下得到的蛹蟲草類胡蘿卜素含量達到 1 747.8± 17.6 μg·g-1，高于Dong[1]使用乙醇為溶劑的超聲輔助提取法得到的蛹蟲草類胡蘿卜素含量（1 270 μg·g-1），結(jié)合本研究對比試驗的結(jié)果可說明酶法提取法具有替代超聲輔助提取法提取蛹蟲草類胡蘿卜的潛力。

由于類胡蘿卜素化合物遇光、酸、氧和高溫時不穩(wěn)定、易降解[15]，張杰[11]和高燕燕[16]的研究也表明蛹蟲草類胡蘿卜素對光、酸、高溫不穩(wěn)定，酸熱法不可避免地會對蛹蟲草類胡蘿卜素造成破壞，并且使用有毒的丙酮作為溶劑還限制了酸熱法應(yīng)用于開發(fā)食品級的蛹蟲草類胡蘿卜素，因此本文未對酶法和酸熱法進行試驗比較。相比于酸熱法，酶法提取的條件更加溫和，試劑更安全環(huán)保，應(yīng)用于蛹蟲草類胡蘿卜素相關(guān)食品、藥品、化妝品的開發(fā)更為可行。至于脂肪酶輔助提取蛹蟲草類胡蘿卜素的含量低于張志軍[13]使用酸熱法得到蛹蟲草類胡蘿卜素含量（2 158 μg·g-1），可能有酶法提取工藝不完善、不同產(chǎn)地不同批次蛹蟲草子實體自身類胡蘿卜素含量存在差異等諸多因素，這些問題有待進一步研究，可通過響應(yīng)面分析或正交實驗對酶輔助提取工藝進行再優(yōu)化，或許能進一步提高該工藝的類胡蘿卜素得率。

通過比較不同配比的TLC展開劑對蛹蟲草類胡蘿卜素的分離效果，篩選得到配比為0.5%乙酸水溶液∶乙醇∶正丁醇∶乙酸乙酯=12∶8∶24∶36的展開劑為最佳展開劑，能將蛹蟲草類胡蘿卜素濃縮液分離成4條清晰的條帶。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，推測4個條帶分別對應(yīng)Dong[1]提取得到的4種蛹蟲草類胡蘿卜素（Cordyxanthin-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）；后續(xù)還需進一步對4個條帶的成分進行結(jié)構(gòu)解析以證實該推測。相比于使用硅膠柱層析和制備型液相純化，使用TLC法純化蛹蟲草類胡蘿卜素操作更簡便，試劑消耗較少，分離速度快，效率高，分離效果直觀可見，更具市場前景。但本研究的結(jié)果離生產(chǎn)應(yīng)用還有差距，試驗中使用了靈敏度高的分析型TLC板，若改用靈敏度較低的制備型TLC板做量產(chǎn)，可能還需要對展開劑配比進行調(diào)整。

天然類胡蘿卜素中大多數(shù)水溶性都較差，極大地限制了它們在食品、藥品等方面的用途。盡管目前已開發(fā)出一些將脂溶性類胡蘿卜素引入水基體系的方法[17]，但不是總能達到理想的溶解度范圍，并且還存在增溶劑有毒的風險[18]。相比于親脂性高的β-胡蘿卜素和番茄紅素，親脂性較低的葉黃素生物利用度更高[19]，因此，蛹蟲草類胡蘿卜素作為一種罕見的水溶性類胡蘿卜素，理論上具有比脂溶性類胡蘿卜素更高的生物利用度，在食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域擁有更廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。因此，本研究旨在開發(fā)一種成本低、效率高、條件溫和、操作簡便、節(jié)能環(huán)保的蛹蟲草類胡蘿卜素的分離純化方法，為蛹蟲草類胡蘿卜素的安全綠色開發(fā)提供有用參考。