張 楠，暴雪艷，郝瑞榮，李清宏

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)模化發(fā)展，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中藥物濫用已成為普遍現象，這些藥物在動物體內蓄積形成藥物殘留和細菌耐藥性[1]，原花青素是從植物中提取的活性成分，作為天然植物飼料添加劑已成為養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。原花青素具有抗氧化、降低血清膽固醇、肝臟膽固醇、甘油三酯的功能，能維持血漿中膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的含量，改善血脂異常[2]，它是由不同數量的兒茶素、表兒茶素和沒食子酸通過C4-C6或C4-C8鍵縮合而成的多聚體[3]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPs）是提取于葡萄籽中的一類植物源性多酚化合物。左晟希[4]通過試驗發(fā)現，在AA肉雞飼料中添加一定量的原花青素、茶多酚，能顯著降低肌肉剪切力、提高肌肉干物質含量，改善肉質。汪水平等[5]研究表明，原花青素可降低兔肉肌肉組織的粗脂肪含量，改善兔肉肉品的物理性狀。隨著對原花青素研究的深入，人們逐漸重視起原花青素作為飼料添加劑對肉品質的影響，但在豬肉方面研究較少。

本試驗通過在飼料中添加不同含量的葡萄籽原花青素，檢測其與豬肉品質相關的肌苷酸（IMP）和肌內脂肪含量（IMF）的影響，及與IMP和IMF相關基因（腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）、腺苷-磷酸脫氨酶基因（AMPD1）、二?；视娃D移酶1基因（DGAT1）、脂蛋白脂酶基因（LPL））的表達量，為葡萄籽原花青素在飼料中的添加量提供參考數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用豬為平均體質量在25 kg左右的杜×長×大三元雜交豬，共48頭；供試葡萄籽原花青素（GSPs）（95%）含79.28%的低聚原花青素，購于天津尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司；供試玉米-豆粕基礎日糧參照NRC（2012）營養(yǎng)需要配制，日糧組成和營養(yǎng)成分含量列于表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)成分含量

主要儀器：高速冷凍離心機（德國，Eppendorf AG）；普通PCR擴增儀（美國，賽默飛世兒科技公司）；實時熒光定量PCR儀（美國，Stratagene）；超凈工作臺BCM-1000（蘇州，蘇信環(huán)境科技有限公司）；微量移液器（德國，Eppendorf AG）；超純水制水儀（香港，力康生物醫(yī)療科技控股集團）；超低溫冰箱（美國，賽默飛世兒科技公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（河北，北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試驗設計

豬隨機分為4組：Ⅰ組.基礎日糧（CK）；Ⅱ組.基礎日糧+100 mg/kg GSPs；Ⅲ組.基礎日糧＋150 mg/kg GSPs；Ⅳ組.基礎日糧+200 mg/kg GSPs。每組3個重復，每個重復4頭豬。飼養(yǎng)試驗期間，試驗豬自由采食和飲水，預先試驗7 d，正式試驗28 d，按照豬場常規(guī)管理程序進行驅蟲和免疫。飼養(yǎng)試驗結束后，禁食12 h，每個重復隨機選取3頭豬屠宰，取背最長肌、肝臟、心臟組織裝入2 mL凍存管，迅速浸入液氮中，再轉入-80℃冰箱，用于肌苷酸、肌內脂肪含量的測定和總RNA的提取。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 IMP含量 采用高效液相色譜法測定，流動相0.05 mol/L，pH＝6.5，甲酸銨溶液（含5%甲醇）；進樣量10μL；流速0.8 mL/min；進樣溫度30℃。

1.3.2 IMF含量 采用索氏提取法（GB/T 5009.6—2003）測定。

1.3.3 IMP和IMP相關基因的檢測

1.3.3.1 總RNA的提取與反轉錄 在無菌條件下提取RNA，用微量核酸蛋白檢測儀進行濃度、純度以及A260/A280（R值）的檢測，質量好的RNA的R值在1.8～2.0，小于1.8說明有蛋白質污染，大于2.0說明RNA部分降解。按照Prime ScriptTMRT Rragent kit with gDNA Earser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行操作，在無菌條件下反轉錄合成cDNA第1鏈。

1.3.3.2 引物的設計與合成 根據NCBI上已公布的ADSL、AMDP1、DGAT1、LPL和內參基因β-actin的序列，用Primer 3 Plus引物設計軟件設計引物序列，由上海桑尼生物科技有限公司進行引物合成。引物序列及產物長度列于表2。

表2 目的基因與內參基因引物序列

1.3.3.3 實時熒光定量PCR反應體系的建立 按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，用反轉錄出的cDNA進行梯度PCR擴增，優(yōu)化反應條件，選擇引物最適退火溫度和調整cDNA濃度。反應條件：95℃條件下預變性30 s；以95℃5 s、60℃30 s為循環(huán)條件進行40個循環(huán)反應。試驗所用反應體系列于表3。

表3 實時熒光定量PCR反應體系

1.4 數據處理

采用2-ΔΔT法計算相對定量結果，所有數據均以SPSS17.0軟件中的ANOVA程序進行單因素方差分析，以LSD法進行多重比較。結果以“平均值±標準差”表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GSPs對豬背最長肌中IMP和IMF含量的影響

表4 日糧添加GSPs對豬背最長肌中IMP和IMF含量的影響

從表4可以看出，與空白組相比，添加GSPs的3個試驗組背最長肌中的IMP含量均極顯著增加（P＜0.01），各組間差異顯著（P＜0.05）；隨著GSPs添加量的增加，IMP含量先增加后減少，其中，Ⅲ組IMP含量最高。與空白組相比，3個試驗組背最長肌中的IMF含量極顯著降低（P＜0.01），各組間差異極顯著（P＜0.01）；隨著GSPs添加量的增加，IMF含量先減少后增加再減少，其中，Ⅳ組IMF含量最少。

2.2 GSPs對豬背最長肌、肝臟和心臟中相關基因表達量的影響

各組豬背最長肌、肝臟和心臟中IMP的相關基因表達列于表5。從表5可以看出，與空白組相比，腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）在背最長肌中表達量降低，各組間差異極顯著（P＜0.01），在添加GAPs的組中，Ⅲ組表達量最高；在肝臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的表達量差異不顯著（P＞0.05），Ⅳ組表達量顯著高于其他3組；在心臟中，各試驗組表達量差異顯著（P＜0.05），其中，Ⅳ組極顯著高于其他組，Ⅲ組極顯著低于其他組。與空白組相比，腺苷-磷酸脫氨酶基因（AMPD1）在背最長肌的表達量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組表達量顯著低于其他3組，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著，Ⅰ組和Ⅳ組與Ⅱ、Ⅲ組間差異顯著（P＜0.05）；在肝臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的表達量差異不顯著（P＞0.05），Ⅰ、Ⅳ組的表達量差異不顯著，Ⅳ組表達量顯著高于Ⅱ、Ⅲ組；在心臟中，Ⅰ、Ⅱ組的表達量均顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），其中，Ⅱ組表達量極顯著高于其他組（P＜0.01）。

表5 豬背最長肌、肝臟和心臟中IMP相關基因表達

各組豬背最長肌、肝臟和心臟中IMF的相關基因表達列于表6。從表6可以看出，二?；视娃D移酶1基因（DGAT1）mRNA的表達量在背最長肌中隨GSPs添加量的增加而減少，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間表達量差異不顯著（P＞0.05），Ⅳ組表達量顯著低于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），雖然也低于Ⅲ組但差異不顯著；在肝臟中，Ⅰ、Ⅳ組間表達量差異不顯著，與其他2組相比，表達量差異極顯著（P＜0.01），Ⅱ組表達量極顯著高于其他組，Ⅲ組表達量極顯著低于其他組（P＜0.01）；在心臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組間表達量差異不顯著，Ⅲ組表達量顯著低于其他組（P＜0.05）。LPL mRNA的表達量在背最長肌中Ⅰ、Ⅱ組間差異不顯著，Ⅲ組表達量極顯著高于Ⅰ、Ⅳ組（P＜0.01）；Ⅳ組表達量極顯著低于Ⅱ、Ⅲ組；在肝臟中，Ⅱ組表達量低于Ⅰ、Ⅳ組，但與Ⅲ組間差異不顯著，Ⅳ組表達量顯著高于其他組（P＜0.05）；在心臟中，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著，Ⅰ、Ⅳ組間差異不顯著，但Ⅱ、Ⅲ組的表達量顯著低于Ⅰ、Ⅳ組。

表6 豬背最長肌、肝臟和心臟中IMF相關基因表達

3 討論

3.1 GSPs對豬背最長肌IMP含量及心臟、肝臟中相關基因表達量的影響

人們研究發(fā)現，多肽類和核苷酸是肉類和肉制品鮮味的主要來源，其中，肌苷酸（IMP）是最強的鮮味物質，已成為評定肉質鮮美的重要指標[6]。IMP在體內有著十分復雜的代謝過程，這其中有10種關鍵酶的參與。腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）主要催化AMP合成的由SACIAR生成AICAR的反應和由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應，ADSL基因的表達可調控IMP含量[7]。腺苷-磷酸脫氨酶（AMPD1）催化AMP脫氨生成IMP。肌苷酸的含量受動物的品種、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境、屠宰時間、肌肉酸堿度、屠宰后處理等因素的影響[8-10]。

曹少奇等[11]對巨型玫瑰冠雞的研究表明，ADSL基因的表達與IMP含量顯著相關，它的高表達可提升IMP含量。STRATIL等[12]研究報道，AMDP1基因定位于豬與肉質胴體性狀相關的QTL位點上，可將其作為豬胴體性狀的候選基因研究。本試驗結果顯示，在日糧中添加GSPs的各組背最長肌中IMP的含量顯著增加，在添加量為150 mg/kg的組中IMP含量高于其他組。以空白組為對照，ADSL基因的mRNA表達量在背最長肌中添加GSPs的組中顯著低于空白組，添加量為100 mg/kg的組表達量顯著低于其他組，在肝臟和心臟中GSPs添加量為200 mg/kg時表達量顯著高于其他組；AMDP1基因的mRNA表達量在背最長肌中添加GSPs的組中同樣極顯著低于空白組，添加量為200 mg/kg的組表達量顯著低于其他組，但在肝臟中200 mg/kg添加量的組表達量最高，在心臟中100 mg/kg添加量的組表達量極顯著高于其他組。這說明在日糧中適量添加GSPs有助于肌肉中IMP含量的增加，同時，添加濃度的不同對IMP相關基因在不同組織中的表達量影響各異。

3.2 GSPs對豬背最長肌IMF含量及心臟、肝臟中相關基因表達量的影響

肌內脂肪（IMF）是沉積于肌肉組織的白色脂肪，由肌內脂肪組織和肌纖維中的脂肪組成。IMF的含量主要影響肉的嫩度、大理石紋評分、滴水損失，IMF含量越高，脂肪含量越多，肉的嫩度越好，大理石紋評分升高，對滴水損失也有一定的保護[13-14]。二?；视娃D移酶1（DGAT1）是甘油三酯合成過程中的唯一關鍵酶，催化脂肪細胞甘油三酯合成反應的最后一步。國內外學者對牛的DGAT1基因遺傳多態(tài)性研究較多，有研究表明，德國荷斯坦牛和夏洛萊牛的背最長肌和半肌腱中的肌內脂肪與K232A變異位點顯著相關[15]。脂蛋白脂酶（LPL）能將極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯催化水解為脂肪酸，以供各組織儲存利用。除游離脂肪酸與血清蛋白結合形成可溶性復合物在血液中運輸以外，其余都是以脂蛋白形式在血液中運輸，LPL對脂肪運輸有重要的調節(jié)作用，其活性高低是脂肪沉積的重要指標[16]。有研究表明，萊蕪黑豬LPL mRNA的高表達對肌內脂肪含量增加有積極的影響[17]。本試驗結果顯示，與空白組相比，在日糧中添加GSPs的各組背最長肌中IMF的含量極顯著降低，在添加量為150 mg/kg的組中IMF含量高于其他添加組。以空白組為對照，DGAT1基因的mRNA表達量在背最長肌中添加GSPs的組中低于空白組，添加量為200 mg/kg的組表達量最低，在肝臟和心臟中GSPs添加量為150 mg/kg時表達量顯著低于其他組；LPL基因的mRNA表達量在背最長肌中GSPs添加量為200 mg/kg的組中顯著低于其他組，但在肝臟中200 mg/kg添加量的組表達量顯著高于其他組，在心臟中100 mg/kg添加量的組表達量最低。這說明在日糧中添加GSPs會減少肌肉中IMF的含量，同時，對IMF相關基因在不同組織的表達量上有一定的影響。馬蕾等[18]研究表明，山楂原花青素對高脂飲食誘導的肥胖小鼠具有降脂作用。李德鵬等[19]研究表明，GSPs對綿羊脂肪細胞的生脂過程具有抑制作用，對前脂肪細胞的分化具有抑制作用。以上研究從不同方面說明了原花青素有降低動物體內脂肪含量的作用，與本試驗結果類似，在本試驗中，GSPs對IMF相關基因mRNA的表達量有一定的影響，但趨勢并不完全一致。在后續(xù)試驗中可對GSPs影響IMF含量的機制做進一步研究。

4 結論

GSPs因具有抗氧化性、清除自由基、提高免疫力等作用而大受人們關注，作為天然添加劑在飼料中有廣泛的應用前景。本試驗結果表明，在生長豬日糧種添加GSPs，有效提高了豬背最長肌中IMP的含量，降低了IMF的含量，并發(fā)現日糧中GSPs添加量為150 mg/kg較為合理，此時，IMP含量最高，IMF含量適中；對IMP、IMF相關基因的表達量也有明顯的影響，但作用機制尚未明確，需做進一步的研究。