閆益波，杜麗英，張伯池，張 凱，張 菁，宋獻(xiàn)藝，程俐芬，李文剛，曹寧賢

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，山西太原030031；3.山西省畜禽繁育工作站，山西太原030001）

線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是動(dòng)物細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，具有基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，堿基突變率高，遺傳上具有自主性及遵循嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn)，為系統(tǒng)發(fā)育和遺傳結(jié)構(gòu)研究的良好素材[1]。其中，片段長(zhǎng)1 220 bp的mtDNA D-環(huán)控制區(qū)（D-Loop）是mtDNA基因組中最主要的一段非編碼區(qū)，控制mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，受到進(jìn)化的壓力較小，進(jìn)化速率最高，最具多態(tài)區(qū)域，尤其在高變區(qū)；由于D-Loop受自然選擇影響較大，存在巨大變異，所以廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物群體遺傳多樣性、物種親緣關(guān)系、種群間系統(tǒng)進(jìn)化分析和分子系統(tǒng)發(fā)生等方面的研究[2-3]。山西太行黑山羊（左權(quán)黑山羊）是一個(gè)重要的地方品種，分布廣而分散、體型外貌多樣、生產(chǎn)用途不突出，受各種因素的影響，目前群體數(shù)量急劇減少。合理保護(hù)和開發(fā)山西太行黑山羊品種資源是山西省畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要任務(wù)。

本研究在前期選育研究的基礎(chǔ)上[4]，對(duì)其mtDNA D-Loop進(jìn)行測(cè)序分析，從系統(tǒng)發(fā)生方面研究山西太行黑山羊的遺傳進(jìn)化，旨在為山西太行黑山羊遺傳資源保護(hù)、開發(fā)和雜交利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品采自左權(quán)縣新世紀(jì)農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司黑山羊種羊場(chǎng)核心選育群，隨機(jī)選取健康成年黑山羊35只（檢查系譜記錄，避免選擇親緣關(guān)系較近的個(gè)體），采集其耳組織樣品于凍存管中，冷藏箱保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA的提取、擴(kuò)增和測(cè)序

采用AXYGEN動(dòng)植物基因組DNA小量制備試劑盒（AP-MN-MS-GDNA-250）進(jìn)行總DNA提取。由于山羊的D環(huán)區(qū)位于細(xì)胞色素B基因（CYTB）和12SrRNA基因中間（圖1），所以需要在CYTB基因和12SrRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物（引物序列為F：TTGATACCTGCTCCTCTTAG和R：CAGTCG AACAYCCCTAYRTT）擴(kuò) 增mtDNA D-Loop，片段大小約1 500 bp。

PCR擴(kuò)增使用的是Vazyme Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增。首先對(duì)樣品稀釋到20 ng/μL，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。輕彈混勻，瞬時(shí)離心收集管壁上的液滴至管底，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體系為50μL，包括基因組DNA（20 ng/μL）1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL）1μL，dNTPMix（10mmol/L）1μL，正向引物（10μmol/L）2μL、反向引物（10μmol/L）2μL，ddH2O 18μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，52.3℃退火15 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。反應(yīng)完成后，取3μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。

PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。在得到適合測(cè)序的PCR產(chǎn)物后，首先對(duì)其進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序PCR反應(yīng)選用的試劑為ABI公司的BDT3.1測(cè)序試劑盒（BigDyeTerminator v3.1），測(cè)序反應(yīng)均按照BDT 3.1使用手冊(cè)進(jìn)行。測(cè)序PCR產(chǎn)物的純化采用乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存，加入10μL甲酰胺，使純化后的干粉充分溶解，隨后置于PCR儀中進(jìn)行變性反應(yīng)，將變性后的樣品采用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN比對(duì)、拼接和校正后，得到完整的序列。格式轉(zhuǎn)換（Bioedit軟件）后，用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)，以MEGA文件格式保存。用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0確定單倍型、多態(tài)位點(diǎn)，構(gòu)建Neighbor Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。再利用DNASP4.0軟件對(duì)核苷酸多樣度（Pi）、單倍型多樣度（Hd）以及平均核苷酸差異數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)35只山西太行黑山羊mtDNA D-Loop區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮清晰，無拖尾（圖2）。擴(kuò)增獲得大小約1 200 bp的片段，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小相符，說明擴(kuò)增效果良好。

2.2 山西太行黑山羊與其他山羊品種mtDNA DLoop區(qū)的核苷酸組成分析

對(duì)35只山西太行黑山羊個(gè)體D-Loop區(qū)序列堿基組成情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明（表1），山西太行黑山羊的D-Loop區(qū)序列長(zhǎng)度為1211～1215bp，其中，1 211 bp 1只、1 212 bp 25只、1 213 bp 6只、1 214 bp 2只，1 215 bp 1只，T、C、A、G這4種堿基平均占比分別為28.44%、26.22%、31.82%、13.52%，C＋G的占比為39.74%（表2）。說明山西太行黑山羊mtDNAD-Loop區(qū)富含A/T堿基，具有一定的偏倚性。20個(gè)黑山羊群體中，大部分個(gè)體的mtDNA D-Loop區(qū)片段長(zhǎng)度分布在1 212～1 213 bp范圍內(nèi)（表3）。

表2 山西太行黑山羊mtDNA D-Loop序列的堿基組成情況

表3 山西太行黑山羊與其他山羊品種mtDNA D-Loop序列的堿基組成比較

2.3 山西太行黑山羊mtDNA D-Loop區(qū)序列多樣性分析

采用DNAsp 5.0軟件對(duì)35條序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，山西太行黑山羊共有34種單倍型（表4），單倍型多樣度（Hd）為0.998，平均核苷酸多樣度（Pi）為0.018 65，平均核苷酸差異度（k）為22.0；其余18個(gè)山羊品種258只個(gè)體中共發(fā)現(xiàn)單倍型210種。對(duì)19個(gè)山羊品種的mtDNA D-Loop區(qū)全序列進(jìn)行Tajima中性顯著性檢驗(yàn)可知，其值變化范圍為-1.297 52～1.787 86，均不顯著，符合中性突變（表5）。

表4 山西太行黑山羊mtDNA D-Loop序列的單倍型分布情況

表5 山西太行黑山羊與其他山羊品種mtDNA D-loop序列遺傳多樣性

2.4 山西太行黑山羊與中外部分山羊品種的遺傳距離分析

遺傳距離是衡量種群間遺傳分化程度和差異大小的重要指標(biāo)。本研究中，對(duì)20個(gè)山羊品種260條序列利用MEGA 4.0軟件分析得到20個(gè)群體品種間遺傳距離（表6），結(jié)果表明，20個(gè)山羊群體品種間的遺傳距離為0.003～0.033；遼寧絨山羊與鳳慶無角山羊之間的遺傳距離較小，為0.003；鳳慶無角山羊與安哥拉山羊的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.033。與山西太行黑山羊遺傳距離由小到大的品種分別為遼寧絨山羊、黃淮山羊、戴云山羊、薩能奶山羊、成都麻羊、圭山山羊、板角山羊、馬頭山羊、川東白山羊、馬關(guān)無角山羊、龍陵黃山羊、云嶺山羊、貴州白山羊、雷州山羊、南江黃山羊、波爾山羊、鳳慶無角黑山羊、隆林山羊、安哥拉山羊。山西太行黑山羊與遼寧絨山羊、黃淮山羊和戴云山羊的遺傳距離最小，為0.014，表明其親緣關(guān)系較近；山西太行黑山羊與安哥拉山羊的遺傳距離最大，為0.029，表明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

LNC MG ZQ YL SA NJ MT離LL距傳Nei's遺LLY的間LZ種品羊HH山他其外GZW中與羊山GS黑行太FQ西山6 DY表CDW CDM BOR BJ AN 0.029種 AN BJ品0.019 0.032 BOR 0.020 0.017 0.028 CDM 0.022 0.020 0.013 0.011 0.025 0.018 0.019 0.014 0.020 0.016 0.023 0.019 0.023 0.021 0.016 0.010 0.022 0.017 0.030 0.025 0.033 0.028 CDW DY FQ GS 0.017 0.020 0.014 0.021 0.019 0.018 0.017 0.016 0.017 0.011 0.020 0.021 0.021 0.021 0.018 0.020 0.018 0.021 0.020 0.020 0.012 0.024 0.024 0.021 0.021 0.024 0.022 0.021 0.022 0.021 0.022 0.017 0.018 0.021 0.020 0.017 0.022 0.025 0.018 0.020 0.021 0.022 0.021 0.021 0.014 0.018 0.017 0.021 0.015 0.019 0.010 0.017 0.014 0.017 0.006 0.017 0.017 0.022 0.024 0.017 0.019 0.020 0.021 0.021 0.021 0.015 0.020 0.013 0.020 0.019 0.022 0.018 0.021 0.015 0.019 0.018 0.019 0.012 0.022 0.021 0.023 0.021 0.025 0.023 0.022 0.021 0.021 0.023 0.022 0.021 0.014 0.007 0.014 0.017 0.020 0.013 0.017 0.011 0.017 0.014 0.017 0.003 0.019 0.014 0.019 0.022 0.025 0.018 0.022 0.018 0.022 0.020 0.022 0.010 0.020 0.013 0.020 0.017 0.021 0.019 0.019 0.014 0.017 0.018 0.018 0.013 0.019 0.020 0.019 0.021 0.024 0.020 0.019 0.021 0.022 0.022 0.021 0.020 0.017 0.013 0.016 0.020 0.023 0.016 0.019 0.017 0.020 0.019 0.020 0.010 0.030 0.025 0.031 0.030 0.033 0.029 0.031 0.027 0.031 0.029 0.030 0.025 GZW HH LZ LLY LL MT NJ SA YL ZQ MG LNC無慶；FQ.鳳羊山白東；CDW.川羊山角無關(guān)；MG.馬羊山山；GS.圭羊羊。山山頭絨；MT.馬寧山；LNC.遼羊羊白山州；GZW.貴云；DY.戴羊羊山山嶺奶；YL.云能羊；SA.薩山羊黃山江淮；NJ.南；HH.黃羊羊山山黑角權(quán)；ZQ.左；BJ.板羊羊山山州林；LL.??；LZ.雷羊羊山麻爾都；CDM.成；BOR.波羊羊山山黃拉陵哥：AN.安；LLY.龍羊注山黑角

2.5 山西太行黑山羊系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)遺傳距離，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建山西太行黑山羊與其他19個(gè)山羊品種間的系統(tǒng)發(fā)生樹，以便直觀地了解20個(gè)種群間的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示（圖3），20個(gè)種群被分為兩大支，安哥拉山羊獨(dú)自形成一支；以我國(guó)的地方山羊?yàn)橹鞯?9個(gè)品種屬于一個(gè)大支，其又分為2個(gè)亞支：龍陵黃山羊與馬關(guān)無角山羊首先聚在一起，然后與貴州白山羊和南江黃山羊聚在一起形成其中一個(gè)亞支；山西太行黑山羊與其他14個(gè)品種聚為一個(gè)亞支，但山西太行黑山羊單獨(dú)聚為一支。

2.6 mtDNA D-Loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)生樹分析

利用NETWORK軟件對(duì)260只個(gè)體繪制了網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析圖（圖4）。從圖4可以看出，20個(gè)山羊群體分為A、B、C、D共4個(gè)不同的支系，且每個(gè)支系呈現(xiàn)“星狀”，分布清晰，沒有交叉。

3 結(jié)論與討論

左權(quán)縣現(xiàn)存的山西太行黑山羊是在當(dāng)?shù)靥厥獾乩砑吧鷳B(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過長(zhǎng)期的人工選擇形成的地方類群。一般認(rèn)為，該類群從分布上屬于太行山羊的范疇，但太行山區(qū)緯度跨度大，羊群分布廣，從而形成了特點(diǎn)鮮明的多種類型，比如從毛色可分為黑、褐、青、灰、白等類型，從生產(chǎn)類型可分為偏絨用和偏肉用2種。已有研究表明，山西太行黑山羊具有抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，尤以產(chǎn)肉性能著稱于國(guó)內(nèi)市場(chǎng)；生產(chǎn)的羊肉具有脂肪分布均勻、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、幾乎沒有難以接受的膻腥味、口感極好，而且蛋白質(zhì)含量高、脂肪及膽固醇含量低、滋補(bǔ)作用強(qiáng)。由于市場(chǎng)對(duì)黑山羊的需求逐年增加，加之封山禁牧政策的影響和長(zhǎng)期缺乏系統(tǒng)科學(xué)的選育，從而導(dǎo)致該品種群體規(guī)模急劇下降，其珍貴的遺傳多樣性和獨(dú)特的遺傳特性正受到破壞和影響，急需對(duì)其進(jìn)行保護(hù)、選育及科學(xué)利用。

mtDNA D-Loop區(qū)多態(tài)性常被作為群體內(nèi)、群體間遺傳多樣性分析方法，本研究通過對(duì)山西太行黑山羊線粒體D-Loop序列與GenBank中收錄的部分品種山羊線粒體D-Loop區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)分析，從系統(tǒng)發(fā)生方面研究山西太行黑山羊的遺傳進(jìn)化，旨在為山西太行黑山羊遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究通過對(duì)35只山西太行黑山羊個(gè)體mtDNA D-Loop區(qū)進(jìn)行測(cè)序及與其他19個(gè)中外山羊品種的mtDNA D-Loop區(qū)全序列進(jìn)行比較分析，并對(duì)其遺傳多樣性及起源進(jìn)化情況進(jìn)行深入分析，結(jié)果顯示，山西太行黑山羊mtDNA D-Loop區(qū)全序列中，A、T、C、G的含量分別為31.82%、28.44%、26.22%和13.52%，堿基組成分析顯示，G相對(duì)缺乏，C＋G的含量為39.74%，A＋T的含量為60.26%，A＋T的含量明顯比G＋C的含量多，說明山西太行黑山羊mtDNA D-Loop區(qū)富含A/T堿基，具有一定偏倚性。這與王杰等[5]對(duì)我國(guó)7個(gè)山羊品種mtDNA D-Loop區(qū)堿基組成的研究結(jié)果較為相似。可能是由于CG含量越豐富序列越趨于穩(wěn)定，而mtDNA D-Loop變異率較高，所以富含A/T堿基[6]。20個(gè)黑山羊群體中，大部分個(gè)體的mtDNA D-Loop區(qū)片段長(zhǎng)度分布在1 212～1 213 bp范圍內(nèi)，與已有研究報(bào)道中的1 212～1 213 bp范圍趨于一致[7]。另外，本研究在35只山西太行黑山羊中共檢測(cè)到34種單倍型，單倍型多樣性及核苷酸多樣性均較高，也證明了山西太行黑山羊具有較高的遺傳變異程度，遺傳多樣性豐富，這與王杰等[5]的研究結(jié)果基本一致。武建亮等[8]利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)8個(gè)山羊品種的分析結(jié)果顯示，單倍型多樣度以太行黑山羊最高，為0.800 3，與本研究的結(jié)果（0.998）接近。山西太行黑山羊與我國(guó)眾多的地方山羊品種一樣，都具有一定的選擇潛力，遺傳多樣性豐富。

一般認(rèn)為，群體中mtDNA核苷酸多樣度（Pi）和單倍型多樣度（Hd）是衡量一個(gè)群體遺傳分化的重要指標(biāo)，Pi值和Hd值越大，群體的多態(tài)程度越高，遺傳多樣性越豐富，大多數(shù)哺乳動(dòng)物的Pi值均大于0.01，0.001～0.007的Pi值范圍被認(rèn)為是缺乏種內(nèi)變異的物種指標(biāo)范圍[9]。本研究中，山西太行黑山羊Pi和Hd值分別為0.018 65和0.998，顯示出較高的群體多態(tài)性，表明山西太行黑山羊群體遺傳多樣性豐富。

從山西太行黑山羊與其他19個(gè)山羊品種間的遺傳距離來看，山西太行黑山羊與遼寧絨山羊、黃淮山羊的遺傳距離最近，為0.014；與鳳慶無角黑山羊和隆林山羊相對(duì)較遠(yuǎn)，遺傳距離分別為0.023和0.024；與安哥拉山羊的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.029，表明山西太行黑山羊在起源進(jìn)化的過程中更多受到東北和華東山羊的影響，而這些地區(qū)冬季寒冷的氣候?qū)γば誀罹哂休^大的選種要求，山西太行黑山羊與遼寧絨山羊、黃淮山羊都以產(chǎn)絨性狀和板皮性狀為優(yōu)，因而群體間起源較近，群體間分化主要由地理隔離造成，分化程度較低。

《中國(guó)羊品種志》認(rèn)為，我國(guó)家養(yǎng)山羊有2個(gè)野生祖先，一個(gè)是角骨羊（Capra aegagrus），另外一個(gè)為旋角野山羊（Capra falconeri）。張文麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，會(huì)理黑山羊與太行黑山羊、成都麻羊、貴州白山羊等我國(guó)地方品種山羊一起和角骨羊聚為一大分支，而旋角野山羊則單獨(dú)聚為一個(gè)分支，角骨羊與我國(guó)山羊親緣關(guān)系較近，對(duì)我國(guó)山羊貢獻(xiàn)較大。本研究顯示，山西太行黑山羊與遼寧絨山羊、黃淮山羊、戴云山羊、薩能奶山羊、成都麻羊、圭山山羊等多個(gè)地方品種存在親緣關(guān)系，與上述研究結(jié)果有部分相似，提示山西太行黑山羊的母系起源為角骨羊，雖然生活在北方，但與南方山羊品種具有一定淵源，可能在長(zhǎng)期進(jìn)化中，由于飼養(yǎng)管理粗放、選育程度較低，受到了不同品種山羊的影響。

利用mtDNA D-Loop區(qū)單倍型構(gòu)建群體系統(tǒng)發(fā)育樹是研究種群遺傳進(jìn)化關(guān)系的常用方法[11]。本研究中，20個(gè)山羊品種系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，其共分為4個(gè)支系，且每個(gè)支系呈現(xiàn)“星狀”，與NJ樹的分析結(jié)果一致，暗示我國(guó)山羊至少存在有4個(gè)獨(dú)立的母系起源，“星狀”分布清晰，無交叉，可進(jìn)一步說明4個(gè)支系間沒有復(fù)雜的遺傳關(guān)系，表明我國(guó)地方山羊品種至少有4個(gè)母系起源。劉益平等[12]研究認(rèn)為，類型A和B是在我國(guó)山羊品種中廣泛存在的類型，而類型C和D則以低頻率存在于我國(guó)部分山羊個(gè)體中，至于是否還有A、B、C、D類型以外的其他新的線粒體D環(huán)類型，各類型在我國(guó)山羊品種中的分布頻率如何，仍需要測(cè)定更多的其他地方山羊品種的材料來檢驗(yàn)和分析，這與本研究結(jié)論基本一致。

總體上，山西太行黑山羊群體的多態(tài)程度高，遺傳多樣性豐富，選育程度較低，應(yīng)當(dāng)注意加以保護(hù)，防止盲目雜交，避免基因庫(kù)的混雜和我國(guó)地方品種某些優(yōu)良基因丟失，以保持我國(guó)山羊品種豐富的遺傳多樣性。