李瑞華，韓明盛，胡 鑫，馬艷琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

砷（As）是一種天然存在的類金屬，幾乎存在于所有環(huán)境介質(zhì)中，如空氣、土壤和水。其中，通過(guò)砷污染的地下水造成的慢性砷中毒嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物健康[1-2]。砷一旦被吸收就會(huì)分布到肝、肺、腸壁、脾臟和心臟等器官，對(duì)機(jī)體造成危害[3]。給予小鼠腹腔注射三氧化二砷（5 mg/（kg·d））10 d，可引起心電圖ST段抬高和QT間期延長(zhǎng)，心肌氧化應(yīng)激增加，抗氧化防御能力下降，心肌膜損傷和炎性因子釋放[4]。胚胎期亞慢性砷暴露會(huì)導(dǎo)致胎鼠心臟畸形，包括室間隔缺損、房間隔缺損和法洛三聯(lián)征[5]。大鼠胚胎期至青春期砷染毒可導(dǎo)致大鼠收縮壓和舒張壓升高，心肌細(xì)胞發(fā)生腫脹、變性等組織病理學(xué)改變，電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察到心肌細(xì)胞線粒體、閏盤(pán)、細(xì)胞核均發(fā)生不同程度改變[6]。然而對(duì)于砷引起心臟毒性機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不深入。

本試驗(yàn)選用C57BL/6小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)飲水砷暴露建立亞慢性砷中毒小鼠模型，利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清心肌酶譜水平，評(píng)估心肌損傷情況，并采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡通路相關(guān)基因的表達(dá)，為進(jìn)一步探討砷致小鼠心肌損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取40只5周齡、體質(zhì)量為20～22 g的SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠用于試驗(yàn)。小鼠購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)飼7 d后，40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及低、中、高劑量砷暴露組，自由飲食和采水。對(duì)照組小鼠飲去離子水，低、中、高劑量組分別飲含0.15、1.50、15.00 mg/L三氧化二砷（As2O3）的去離子水。試驗(yàn)周期為90 d。所有試驗(yàn)均符合山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的章程。

試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠稱質(zhì)量、麻醉，腹主動(dòng)脈采血，收集血清于-20℃保存；同時(shí)分離心臟組織并稱質(zhì)量，按照公式計(jì)算不同濃度砷暴露組間臟器系數(shù)后，液氮保存用于基因表達(dá)檢測(cè)；部分心臟置于4%多聚甲醛中固定，用于石蠟切片制作。

1.2.2 血清心肌酶活性測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清心肌酶活力，其中，肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）采用速率法測(cè)定；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）采用蘋(píng)果酸脫氫酶法測(cè)定。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率 心臟組織常規(guī)制作石蠟切片，脫蠟至水，利用生物素標(biāo)記的dUTP（Biotin-dUTP）結(jié)合到切片中凋亡細(xì)胞DNA暴露的3′-OH端，隨后和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的Streptavidin（Streptavidin-HRP）結(jié)合，最后在HRP的催化下通過(guò)DAB顯色，于顯微鏡下觀察凋亡心肌細(xì)胞。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)心臟基因表達(dá)水平 采用Trizol法提取心臟總RNA，測(cè)定RNA純度和濃度。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，SYBR Green法進(jìn)行qRT-PCR，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用one-way analysis of variance（ANOVA）進(jìn)行分析，Dunnett法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷對(duì)小鼠心臟組織臟器系數(shù)的影響

攻毒90 d后，小鼠一般狀況良好，各組小鼠全部存活，采食量和飲水量未見(jiàn)明顯改變，毛色光亮，反應(yīng)靈敏。從表1可以看出，不同濃度砷暴露組的小鼠心臟臟器系數(shù)均有所下降。其中，中劑量組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），高劑量組與對(duì)照組間差異極顯著（P＜0.01）。

表1 不同濃度砷暴露對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

2.2 砷對(duì)小鼠血清心肌酶活力的影響

表2 不同濃度砷暴露對(duì)小鼠血清心肌酶活力的影響 U/L

由表2可知，不同濃度砷暴露后，小鼠血清心肌酶活力與對(duì)照組相比，低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯改變，中、高劑量組血清AST、LDH、CK、HBDH活力均顯著升高，且隨染毒劑量的增加而增加。

2.3 砷暴露對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡通路基因表達(dá)的影響

采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)不同處理對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃至棕褐色，核形態(tài)為長(zhǎng)橢圓形，胞質(zhì)染色較淺。對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)有凋亡心肌細(xì)胞；低、中劑量組中偶見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞，多分布在心內(nèi)膜、心外膜下，凋亡率分別為16.02%、10.64%；高劑量組凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，凋亡率達(dá)到24.2%。

采用熒光定量PCR方法檢測(cè)了不同濃度砷暴露小鼠心臟凋亡通路相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，中、高劑量組促凋亡蛋白調(diào)節(jié)因子Bax的表達(dá)顯著升高，分別為對(duì)照組的1.24倍和1.31倍（P＜0.05）?？沟蛲龅鞍渍{(diào)節(jié)因子Bcl-2的基因表達(dá)量在中、高劑量組均顯著降低，分別為對(duì)照組的88%（P＜0.05）和62%（P＜0.01）；高劑量組與低劑量組或中劑量組相比，表達(dá)量也顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度砷暴露后，凋亡效應(yīng)分子Caspase-3的基因表達(dá)均升高，低劑量和中劑量組的相對(duì)表達(dá)量分別增加了22%和18%，但差異不顯著（P＞0.05）；高劑量組Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量增加了46%，差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

3.1 砷暴露對(duì)小鼠血清心肌酶活力的影響

當(dāng)心肌組織因多種原因發(fā)生炎癥、壞死時(shí)，心肌細(xì)胞中所含的酶類即可進(jìn)入血液中。因此，血液中心肌酶譜的水平可反映心肌損傷的程度[7-8]。心肌酶譜的測(cè)定主要包括：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）等[9]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，是心肌中重要的能量調(diào)節(jié)酶[10]。AST也是體內(nèi)最重要的氨基轉(zhuǎn)移酶之一，心肌中AST含量最為豐富[11]。血清CK、CK-MB、AST靈敏度和特異性均較高，已成為公認(rèn)的反映心肌細(xì)胞損害的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]。LDH幾乎存在于所有組織中，以心臟、骨骼肌和腎臟中含量最為豐富。LDH增高主要見(jiàn)于肝炎和心肌梗死等，其同工酶存在明顯的組織特異性，可用于心肌疾病的診斷[12]。α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）的本質(zhì)還是LDH，反映了以羥丁酸作為底物時(shí)的LDH1和LDH2的作用，其活力可持續(xù)14 d或更長(zhǎng)時(shí)間[13]。本試驗(yàn)中，1.50、15.00 mg/L As2O3暴露后，小鼠血清中AST、CK、LDH、HBDH的酶活力均顯著增加，表明砷暴露對(duì)小鼠心肌造成特異性損傷，且隨著染毒劑量的增加損傷程度加重。

3.2 砷暴露對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格受到細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的自主性消亡的過(guò)程[14-15]。凋亡通路核心分子家族成員有2個(gè)：Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族成員中，有一類抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子為代表[16]；還有一類促進(jìn)凋亡發(fā)生的分子，以Bax分子為代表[17]。Caspase家族成員中，一類是凋亡啟動(dòng)分子，包括Caspase-2、8、9、10；另一類是凋亡效應(yīng)分子，包括Caspase-3、6、7；還有一類Caspase的亞家族分子和凋亡的關(guān)系不大[18]。SUN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，并以時(shí)間依賴性方式上調(diào)凋亡基因Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，從而切斷核小體間的DNA使其發(fā)生斷裂暴露3′-OH，因此，可利用TUNEL法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡[20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度砷暴露組中均可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞，高濃度砷暴露組凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2以及Caspase-3 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)砷暴露上調(diào)了小鼠心肌組織中Bax及Caspase-3的表達(dá)，下調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，表明亞慢性砷暴露可誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。