郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學工學院，山西太谷030801）

蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)是需要多種蛋白分子參與的復雜的化學信號通訊過程，其嗅覺感知起始于表達在嗅覺受體神經(jīng)元（OSNs）上的特異性氣味受體（Olfactor Receptor，ORs）識別并區(qū)分周圍環(huán)境（包括群內(nèi)及外界環(huán)境）中的氣味分子，相應的氣味分子與其同源的特異性氣味受體ORs結合激活信號轉導級聯(lián)反應，打開離子通道，從嗅覺受體神經(jīng)元向大腦發(fā)送電信號，并產(chǎn)生氣味相關動作電位。昆蟲OR具有與哺乳動物的G蛋白偶聯(lián)受體截然相反的7個跨膜拓撲結構（即N端位于細胞內(nèi)，C末端位于細胞外），與哺乳動物氣味受體之間無同源性[1-3]。在昆蟲體內(nèi)，氣味受體主要位于嗅覺神經(jīng)元樹突上[4-5]，參與嗅覺信號識別的初始過程。每個嗅覺神經(jīng)元表達2類氣味受體：高度保守的共受體Orco和傳統(tǒng)的氣味受體[6-9]，其中，傳統(tǒng)的氣味受體在不同昆蟲間差異較大，可分為性信息素受體和普通受體[10-12]；而Orco在不同昆蟲間則高度保守[1，3]，不可以識別氣味分子，但能幫助傳統(tǒng)的氣味受體在樹突膜上的折疊和正確定位。

山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院蜜蜂研究課題組在之前的研究中從中華蜜蜂（Apis cerana cerana）克隆并鑒定出一個共受體基因AcerOr2（GenBank登錄號：JN 792581），并且發(fā)現(xiàn)在工蜂觸角發(fā)育的各個階段AcerOr2都有表達[13]，與意大利蜜蜂（Apis cerana）共受體AmelOr2有類似的表達譜[14]，結果表明，中華蜜蜂共受體AcerOr2可能參與了性別和分工等嗅覺感知過程。蜜蜂的氣味受體在其親屬辨認、采集食物、工蜂監(jiān)督和防御等行為上起著重要的作用[15]，但是與果蠅和蚊子等其他昆蟲相比，有關蜜蜂Ors功能的研究相對較少。

本研究通過構建相應的AcerOr2干擾質粒，并篩選出最佳的干擾序列，旨在為將來通過RNAi進一步研究AcerOr2功能的相關機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試蜜蜂 中華蜜蜂（Apis cerana cerana）飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學中蜂試驗場。取封蓋子脾放置于人工氣候箱（溫度32℃、相對濕度65%±5%），待出房后將蜜蜂放置于飼喂盒（10 cm×5 cm）中（將培養(yǎng)箱溫度調(diào)整為28℃，濕度不變）。

1.1.2 主要試劑、菌株、質粒 TrizolRReagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCRKit和SYBR SYBRRPremix Ex TaqTMIIKit購自TaKaRa公司；JM109、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒、WizardRSVGel and PCRClean-Up System試劑盒和pGEMRT Easy載體購自Promega公司；Eco R I和Bam H I購自NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Omega公司；Plasmid Mini Kit購自康為世紀公司；TOP10、昆蟲細胞蛋白提取試劑盒購自生工生物工程有限公司；辣根過氧化物酶酶標羊抗兔β-actin、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光底物等購自Boster公司；AcerOr2多克隆抗體購自北京京成天脈公司。

1.2 方法

1.2.1 AcerOr2基因dsRNA的合成 以NCBI上AcerOr2（JN792581）和GFP（JQ064510.1）基因cDNA編碼區(qū)（ORF）為模板，使用Primer Premier 6.0設計目的基因AcerOr2的3個不同片段大小的引物和內(nèi)參GFP的1個片段引物（表1），并在引物5′端添加T7啟動子序列（TAATACGACTCACTATAGGG）。以克隆測序后確認含有目的基因AcerOr2部分序列的質粒DNA作為模板進行PCR擴增（94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min）。使用WizardRSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒（Promega）對PCR產(chǎn)物進行純化，并對純化后的PCR產(chǎn)物進行定量，使其滿足體外合成dsRNA的量。根據(jù)T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒操作手冊，使用T7 RNA聚合酶將上述回收的DNA產(chǎn)物體外合成dsRNA，濃度測定后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中華蜜蜂飼喂dsRNA試驗 試驗設置ds-GFP、dsAcerOr2-1、dsAcerOr2-2、dsAcerOr2-3共4個處理組，每組處理重復3次。取新出房后饑餓2 d的蜜蜂，每只使用移液槍飼喂10μgdsRNA，后置于恒溫箱（溫度28℃，相對濕度65%）中飼養(yǎng)。每天更換新鮮飼料并采集樣品。

1.2.3 RNA干擾效果檢測

1.2.3.1 qPCR檢測干擾效果 采集飼喂dsRNA后4日齡的蜜蜂液氮速凍，提取RNA，反轉錄cDNA，進行qPCR檢測（95℃預變性30 s；95℃變性5 s，57℃退火40s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min）。所用引物列于表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.3.2 蛋白質印跡檢測干擾效果 采用昆蟲細胞蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，以每孔上樣10μL進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，半干后轉至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。一抗AcerOr2（1∶1 000）4℃過夜，二抗驢抗兔IgG室溫溫育2 h，ECL顯色，經(jīng)顯定影處理后，使用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及差異顯著性檢驗，統(tǒng)計方法采用Duncan test（P＜0.05）進行。

2 結果與分析

2.1 dsRNA模板合成檢測

以中華蜜蜂（Apis cerana cerana）氣味受體AcerOr2（JN792581）和GFP（JQ064510.1）基因全長為模板，克隆得到含有T7啟動子的AcerOr2和GFP基因片段后，測序驗證，結果顯示（圖1、2），氣味受體AcerOr2的3個大小不同片段的dsRNA合成模板和GFP的1個dsRNA合成模板均已加上T7啟動子（綠色），該產(chǎn)物可以回收用于下一步dsRNA合成。

2.2 體外合成的dsRNA檢測

將合成的大小不同片段的dsRNA經(jīng)濃度檢測結果顯示，其質量濃度均在8～10μg/μL。隨后各取1μL 10倍稀釋后進行電泳檢測，結果如圖3所示，體外合成的中華蜜蜂AcerOr2（4～6）和GFP（7）的dsRNA片段大小與目標片段大小一致，可用于后續(xù)的基因沉默。

2.3 最佳干擾片段篩選

用qPCR檢測不同片段的干擾效果，結果如圖4所示，飼喂3個片段大小不同的dsRNA（dsRNA AcerOr2-1（411 bp）、dsRNA AcerOr2-2（205 bp）、dsRNA AcerOr2-3（471 bp））后對AcerOr2的表達量干擾效果不一樣，且3個片段dsRNA分別以69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%的抑制率抑制AcerOr2的表達，其中，471 bp的dsRNA AcerOr2-3抑制效率最佳。因此，選擇其進行后續(xù)干擾試驗。

用Western Blot進一步檢測不同片段干擾效果，結果如圖5所示，與飼喂dsGFP對照組相比，飼喂 dsRNA AcerOr2-1、dsRNA AcerOr2-1、dsRNA AcerOr2-3后目的蛋白的表達量均有不同程度降低，其中以dsRNA AcerOr2-3抑制率最佳。綜合上述RNA檢測結果，合成的dsRNA干擾片段在蛋白和RNA水平均能干擾AcerOr2的表達。

3 結論與討論

RNA干擾是由小的非編碼雙鏈RNA誘發(fā)的真核細胞中基因沉默的現(xiàn)象，具有高效、快速、穩(wěn)定、特異性強等特點，是昆蟲嗅覺相關蛋白功能研究常用的方法[16]。能否順利將外源dsRNA導入細胞是誘發(fā)RNAi效應成功與否的關鍵。

將外源dsRNA導入昆蟲體內(nèi)并誘發(fā)RNAi常用的方法主要有浸泡法、注射法、飼喂法[17-18]。其中，飼喂法是所有方法中操作最簡便且是對昆蟲造成機械損傷最小的方法，該方法最先是由FIRE發(fā)現(xiàn)，通過飼喂線蟲Caenorhabditis elegans dsRNA可以誘發(fā)RNA干擾效應[19]。隨后在蟋蟀（Gryllus bimaculatus）[20]、白蟻（Reticulitermes flavipes）[21]、意大利蜜蜂（Apis melliferads）[22]等多種昆蟲上都通過飼喂法成功干擾相關基因的表達。本研究采用飼喂法，并誘發(fā)中華蜜蜂體內(nèi)氣味受體RNA干擾效應，可為中華蜜蜂AcerOr2基因功能研究提供理論基礎。

許多研究證明，長鏈dsRNA較短鏈dsRNA在昆蟲中干擾效果更明顯。例如在對果蠅（Drosophila）胚胎的RNA干擾中發(fā)現(xiàn)，長度為300～1 000 bp的dsRNA干擾活性最大，且RNAi效果隨dsRNA鏈的增長而增強[23]。而對于同源性很高的基因，長鏈dsRNA則可能造成非靶標基因沉默的現(xiàn)象，這時短鏈dsRNA的干擾效果最好。本研究對中華蜜蜂氣味受體AcerOr2設計并合成了3個不同大小的dsRNA片段進行RNAi，結果顯示，411 bp的短鏈dsRNA沉默效果最好，說明本試驗所選的基因dsRNA片段大小對RNAi作用效果明顯。

GFP是在水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質，中華蜜蜂體內(nèi)沒有該蛋白質，所以在昆蟲RNAi中常被用作對照，以排除核酸本身對中華蜜蜂的影響；通過比較得出，目的基因表達量下降確實是由飼喂目的基因dsRNA所引起，而不是由飼喂外源基因dsRNA所引起。

與飼喂dsRNA GFP對照組相比，RNA干擾后中華蜜蜂體內(nèi)AcerOr2蛋白相對表達量顯著下降，而內(nèi)參β-actin蛋白相對表達量沒有發(fā)生變化，說明內(nèi)源性目的基因AcerOr2被特異性抑制，并不是由于其他基因的沉默所導致。

本研究結果表明，通過飼喂中華蜜蜂dsRNA介導RNAi的方法對氣味受體AcerOr2基因在其體內(nèi)的干擾效果進行初步檢測，結果顯示，飼喂dsAcerOr2后能顯著降低中華蜜蜂體內(nèi)Acer Or2 mRNA和蛋白表達水平，研究結果為后續(xù)進一步研究中華蜜蜂氣味受體AcerOr2功能打下了基礎。