田志雄，李娜娜，盧曉曉，2，郭 敏，張 寧，李 欣，張 鼎，趙宇軍，閆 芳，高榮琨，寧官保，田文霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.溫縣農(nóng)林局，河南溫縣454850；3.晉城市科學(xué)技術(shù)局，山西晉城048000）

包括脂肪酸（FAs）等在內(nèi)的脂類是所有細胞的基本生化組成，具有多種生物學(xué)作用，即作為生物膜的結(jié)構(gòu)成分、能量來源和一系列細胞調(diào)節(jié)功能等[1]。脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一種質(zhì)量較小的水溶性蛋白，迄今為止，已鑒定出12個FABP家族成員，其中，10個亞型也在人類中表達[2-3]。FABPs主要參與動物體內(nèi)的脂肪酸代謝，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力[4]。細胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（Extracellular Fatty Acid-binding Protein，Ex-FABP）是一種雞胚發(fā)育過程中表達于肥大軟骨、肌肉纖維和血粒細胞中的脂蛋白，最初命名為Ch21，后來由于其結(jié)合特性而被重新命名為Ex-FABP[5]。這個低分子量蛋白屬于lipocalin家族，其家族共享相似的b-桶三級結(jié)構(gòu)[6]。因此，細胞外脂肪酸結(jié)合蛋白與親脂性小分子物質(zhì)（如類維生素A、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、信息素和增香劑等）具有相同的功能[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，胞外脂肪酸結(jié)合蛋白還具有控制細胞凋亡的功能[8]。

本試驗通過原核表達方法克隆雞Ex-FABP基因，將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，然后與pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）進行誘導(dǎo)表達蛋白，最后經(jīng)鑒定得到Ex-FABP蛋白，旨在為后續(xù)進行動物體內(nèi)試驗以及家禽疾病的研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a載體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實驗室保存；Trizol、PCR聚合酶購自大連TaKaRa公司；DNA ladder、DNA loading buffer購自中科瑞泰生物有限公司；Agarose-G10購自Biowest公司；限制性核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ購自New England Biolabs公司；pGEM-TEasy克隆載體購自Promega公司；SDS、Glycine、Coomassie Blue Staining Solution和50×TAE緩沖液購自北京博奧拓達公司；Anti-6×His tag抗體購自Abcam公司；Carnamycin sulfate、SYBRGreen I核酸染料、氨芐青霉素、丙烯酰胺、Imidazole、甲叉丙烯酰胺、Ammoniumpersulphate、四甲基乙二胺、蛋白Marker、麗春紅、羊抗小鼠IgG二抗和NC膜購自Solarbio科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 按照NCBI中公布的雞Ex-FABP基因序列（AF121346.1），通過使用DNAMAN、Primer軟件設(shè)計引物，并在上下游引物添加酶切位點Eco RI和Xho I以及保護性堿基。

上游引物：5′-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCC GGA-3′；下游引物：5′-AGCTCTCGAGCTACACTTC ATCAAGCTGCAT-3′。

1.2.2 Ex-FABP基因克隆與鑒定 取雞的脛骨生長板，使用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進行PCR擴增，通過凝膠電泳檢測結(jié)果，并回收目的條帶。

1.2.3 雞Ex-FABP重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定采用雙載體系統(tǒng)構(gòu)建目的質(zhì)粒，即首先將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，獲得重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP；然后取適量重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP和表達質(zhì)粒pET-28a（+）同時進行酶切，并檢測結(jié)果；用T4 DNA連接酶將Ex-FABP基因和pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞，接于LB板上，通過Kana抗性選出陽性菌落進行PCR鑒定；將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后進行測序分析，獲得表達載體pET-28a-Ex-FABP。

1.2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化將重組質(zhì)粒pET-28a-Ex-FABP轉(zhuǎn)入到BL21（DE3），接種到含Kana的LB板上，37℃培養(yǎng)12 h；隨機挑取單菌落于含Kana的LB培養(yǎng)基，當(dāng)OD600為0.5～0.7時添加IPTG誘導(dǎo)；誘導(dǎo)結(jié)束后進行細菌破碎，12 000 r/min 4℃離心30 min，然后分別通過SDSPAGE鑒定沉淀或上清中蛋白表達情況。

鑒定蛋白表達形式后，菌液繼續(xù)進行分組誘導(dǎo)培養(yǎng)，以摸索誘導(dǎo)表達的最佳條件。分別從IPTG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）、誘導(dǎo)溫度（25、30、37℃）、誘導(dǎo)時間（6、12、21 h）3個方面來檢測誘導(dǎo)條件對Ex-FABP表達的影響。

1.2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化 以最佳的誘導(dǎo)條件繼續(xù)進行誘導(dǎo)表達，之后收集菌體，PBS洗菌3次，使用超聲波裂解破碎細菌，吸取上清，用無菌濾器過濾。本試驗選擇的載體為pET-28a（+），攜帶有His標(biāo)簽，可直接進行鎳柱層析法純化蛋白。將無菌過濾的樣品與Binding Buffer等比例混合上柱，分別用不同濃度（10、20、30、40 mmol/L）的咪唑洗雜，用500 mmol/L的咪唑沖洗Ex-FABP蛋白，收集Ex-FABP蛋白，通過SDS-PAGE鑒定結(jié)果。

1.2.6 Western Blot鑒定Ex-FABP重組蛋白 SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，用麗春紅染色，再用蒸餾水洗脫，脫色后的膜加入TBST稀釋的5%脫脂奶粉進行封閉；加入用1∶1 000稀釋的Anti-6×His tag抗體，4℃孵育4 h；回收抗體后用TBST洗滌3次；再加入用TBST按1∶5 000稀釋的IgG抗體，37℃搖動孵育1 h；TBST洗滌后取出NC膜，將ECL發(fā)光液均勻覆蓋于膜表面，放入暗盒中觀察，掃描記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因PCR擴增結(jié)果

預(yù)期的Ex-FABP基因大小為495 bp，在500 bp左右出現(xiàn)條帶（圖1），表明擴增得到了目的基因Ex-FABP。

2.2 重組克隆質(zhì)粒T-Ex-FABP的序列測定結(jié)果

菌液PCR結(jié)果顯示，在500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶（圖2），提取質(zhì)粒后送上海美吉生物公司進行測序，結(jié)果顯示，序列同源性為99%，表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 p ET-28a-Ex-FABP表達載體的鑒定

重組表達質(zhì)粒用Eco RⅠ和XhoⅠ同時酶切后進行鑒定，可見相應(yīng)的2條電泳帶（圖3），并且Ex-FABP基因在500 bp左右位置，序列經(jīng)過分析后完全正確，證明重組pET-28a-Ex-FABP質(zhì)粒連接成功；同時空質(zhì)粒pET-28a也進行雙酶切，結(jié)果顯示，有相應(yīng)的一條帶（圖3）。

2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化

2.4.1 Ex-FABP重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將重組載體轉(zhuǎn)入BL21（DE3），得到含有目的基因的BL21/Ex-FABP，誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE鑒定，加上His標(biāo)簽后Ex-FABP蛋白大約是24 ku，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后菌液在20.1～31.0 ku有一條帶；未誘導(dǎo)菌液在相同位置無條帶（圖4）。并且，Ex-FABP重組蛋白在上清和沉淀中均有分布，取同等上樣量進行檢測發(fā)現(xiàn)，上清中蛋白表達量遠高于沉淀（圖5）。

2.4.2 Ex-FABP重組蛋白表達的條件優(yōu)化 利用SDS-PAGE對蛋白表達的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間進行檢測，結(jié)果顯示，0.2 mmol/L IPTG、30℃、21 h為Ex-FABP重組蛋白表達的最佳條件（圖6～8）。

2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化及鑒定

2.5.1 Ex-FABP重組蛋白的純化 Ex-FABP重組蛋白的裂解液上清經(jīng)純化后，用500 mmol/L的咪唑沖洗，可得到較純的目的蛋白（圖9）。

2.5.2 Ex-FABP重組蛋白的免疫印跡鑒定結(jié)果由圖10可知，通過Western Blot鑒定純化后，上清中出現(xiàn)單一特異性條帶，即純化得到目的蛋白Ex-FABP；而未誘導(dǎo)菌液中無條帶。

3 結(jié)論與討論

脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一類與配體相關(guān)的水溶性蛋白，其大小為14～15 ku，在與高代謝活性和脂質(zhì)存儲相關(guān)的組織中大量表達，迄今為止，已鑒定出12個FABP家族成員[9-10]。盡管最初是根據(jù)首次描述FABP表達的組織類型命名，但是后來發(fā)現(xiàn)有些FABP成員在多個組織中都有表達，并且可以共同表達。雖然FABP家族成員只表現(xiàn)一定的序列同源性，但是不同家族成員之間的三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相似，由10條反平行的β鏈組成，形成β桶結(jié)構(gòu)[3]。FABP表達的失調(diào)可能是通過基因突變或環(huán)境生活方式的影響而發(fā)生。近年來，F(xiàn)ABP在腫瘤生物學(xué)中的作用越來越多地被報道，外源性FABP的表達升高與腫瘤的進展和侵襲性有關(guān)，但內(nèi)源性FABP過表達的作用還有待進一步研究。

Ex-FABP是一類不含甘露糖的蛋白質(zhì)，具有鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)象，可抵抗有限的胃蛋白酶消化[11]。BEDARD等[12]也發(fā)現(xiàn)了相同的蛋白，分泌于雞胚成纖維細胞和雞心臟間充質(zhì)細胞，稱為p20K蛋白。ExFABP和p20K都是禽類蛋白，在其他物種特別是小鼠和人中還沒有明確的同源性。在分化軟骨和肌管時，炎癥因子（脂多糖等）明顯上調(diào)Ex-FABP蛋白合成；而抗炎藥抑制生理表達的蛋白合成，并且阻止脂多糖誘導(dǎo)的蛋白合成[13]，表明Ex-FABP可能在肌管分化和成熟過程中發(fā)揮反饋（自分泌）控制作用，并可能在維持細胞活力方面發(fā)揮作用[14]。本試驗通過引物設(shè)計獲取雞Ex-FABP基因，并連接到質(zhì)粒pET-28a（+）上，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）進行培養(yǎng)，摸索最佳誘導(dǎo)條件，表達了大量純度比較高的Ex-FABP蛋白，結(jié)果為后續(xù)的動物試驗以及家禽疾病的研究提供了依據(jù)。

本試驗選擇的是原核表達體系，其可以快速得到大量的目的蛋白，而且所需的成本比較低，方法也比較簡單，可以表達的蛋白也比較多[15]。缺點在于表達出來的蛋白沒有經(jīng)過修飾，不一定有天然的活性[16]，且無法調(diào)控水平和時間，蛋白經(jīng)常存在于包涵體中，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難。真核表達系統(tǒng)雖然可以進行相應(yīng)的修飾，但是周期較長，速度慢，獲得的蛋白產(chǎn)量低。本試驗采用的是原核表達系統(tǒng)，但是Ex-FABP為真核基因，所以后期還需要進行加工修飾，即表達出的蛋白需經(jīng)過透析等過程，使蛋白具有功能活性。

在原核體系中，最常用的宿主菌為大腸桿菌，其具有背景明確、快速便捷、產(chǎn)量較高的優(yōu)點[17-18]。目前，在大腸桿菌表達體系中，最常用的質(zhì)粒有pET、pGEX等。這2種系列表達質(zhì)粒均帶有純化標(biāo)簽，即His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽[19]。而由于His標(biāo)簽具有分子量小、免疫原性低、無需處理即可進行動物體內(nèi)試驗等特點，以及考慮到本試驗的下游試驗所需蛋白要求，故選用了存在His標(biāo)簽的pET-28a（+）質(zhì)粒。而且選擇pET系統(tǒng)表達蛋白時，如果不添加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)表達過程幾乎不進行。本試驗根據(jù)pET-28a（+）的質(zhì)粒圖譜，在引物設(shè)計時選擇Eco RⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，使Ex-FABP基因可以順利連接到pET-28a（+）載體上，并且本試驗選用了適合pET表達載體的BL21（DE3）菌株作為宿主菌。

為了得到大量的重組Ex-FABP蛋白，本試驗還對IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及時間進行了分組測定，結(jié)果得出，IPTG濃度對試驗沒有較大影響；溫度為30℃時的表達量要高于25、37℃；誘導(dǎo)時間為21 h時蛋白表達量高于6、12h。即IPTG終濃度0.2mmol/L、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時間21 h為Ex-FABP蛋白表達的最佳誘導(dǎo)條件。

本試驗成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-Ex-FABP，并對重組Ex-FABP蛋白進行了純化、SDS-PAGE和Western Blot鑒定，得到了純度較高的重組蛋白，構(gòu)建了一套雞Ex-FABP蛋白的表達程序，結(jié)果可為后續(xù)的動物試驗以及家禽疾病的研究提供理論依據(jù)。