熊 鑫

（安徽省寧國市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，安徽 寧國 242300）

1 試驗方法

1.1 樣本制備

①于屠宰環(huán)節(jié)隨機選取某養(yǎng)殖場雞祖代（80周齡）及父母代（48周齡）各50只；

②通過翅靜脈采集血液，于37℃放置2h；

③取上清液在1800r/min條件下離心2～3min，用移液器吸取上層清液（即為血清）于新的離心管中；

④進行編號標記后于-20℃保存。

1.2 制備1%雞紅細胞懸液

①注射器吸取適量阿氏液，通過翅靜脈采集健康公雞血液；

②于1500r/min條件下離心8～10分鐘，用移液器盡可能吸凈上層清液棄去；

③加入生理鹽水通過稱量配平后，用移液器重復吹打使懸液充分混勻；

④重復②③步驟3～5次；

⑤離心后將上層清液棄掉，用生理鹽水配成1%紅細胞懸液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HA試驗

①取1塊96孔V型微量反應板水平放置于實驗臺，進行標記；

②分別選取6排，其中每2排為重復操作，第1～12孔分別加入25μL生理鹽水；

③分別于相應標記的第1孔加入H5、H7和H9抗原25μL，倍比稀釋至第11孔，棄去槍頭內液體；

④6排的每孔加入25μL生理鹽水；

⑤6排的每孔加入配制好的25μL 1%紅細胞懸液，振蕩混勻后于37℃恒溫箱內反應15～20分鐘；

⑥觀察結果，獲得抗原血凝效價，制備抗原稀釋液。

1.4 HI試驗

①取96孔V型微量反應板進行標記；

②每塊板第1～11孔每孔內加入25μL生理鹽水，第12孔則加入50μL；

③于反應板每排的第1孔、第6孔加入對應血清樣本25μL，分別倍比稀釋至第5孔、第10孔，棄去槍頭內液體；

④于第1～11孔加入25μL配制好的H5抗原稀釋液，振蕩混勻，于37℃反應15～20分鐘；

⑤每孔加入25μL 1%紅細胞懸液，振蕩混勻后放置于37℃反應15～20分鐘；

⑥結果判定，獲得抗體水平；

⑦根據(jù)以上方法測得H7和H9抗體水平效價。

2 試驗結果

2.1 HA試驗

以完全血凝的病毒稀釋倍數(shù)往前推進2個滴度即為我們需要的四個血凝單位，如圖2-1結果顯示H5抗原的稀釋倍數(shù)為1：28。H7抗原的稀釋倍數(shù)為1：28。H9抗原的稀釋倍數(shù)為1：27。根據(jù)結果分別配制H5、H7和H9抗原稀釋液，標記后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HI試驗

根據(jù)試驗結果，讀取血清的紅細胞凝集抑制效價，分析結果發(fā)現(xiàn)，H5抗體合格率中祖代和父母代的均為100%；H9抗體合格率同樣為100%；H7合格水平率中祖代的為78%，父母代的為72%。本次試驗樣本的檢測結果發(fā)現(xiàn)H5、H7和H9抗體水平合格率均較高，并且符合農(nóng)業(yè)部對禽流感抗體水平合格率的相關要求。

該樣本經(jīng)過免疫H5、H7和H9疫苗，經(jīng)結果分析發(fā)現(xiàn)各疫苗免疫之間互不干擾，均可達到其預期效果，產(chǎn)生較高的抗體水平。

1：HI試驗結果-H5；2：HI試驗結果-H7；3：HI試驗結果-H9

表2-2 HI試驗結果

3 結果分析

HI試驗結果顯示，祖代與父母代的免疫效果合格率無明顯差別，且經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)H5和H9的抗體水平合格率均達到了100%，H7抗體水平合格率分別為78%和72%，也達到了70%以上，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關公告，H7N9群體免疫合格率需要達到70%以上（家禽抗體滴度≥24），相關農(nóng)業(yè)部門才可出具動物檢疫合格證明，可跨省調運。在抗體合格率上，H5和H9的抗體合格率高于H7的抗體合格率，這可能由不同病毒株之間的不同特性導致，因此，在利用HI試驗檢測進行免疫評估時不得不注意其中的差異。本次試驗結果該養(yǎng)殖場屠宰環(huán)節(jié)中采集的祖代及父母代樣本的禽流感H5、H7和H9抗體合格率均達到相關要求。