劉彩云 祝泉馨 方彥昊 張文齊 張建梅鄧祿印 祝 英* 王治業(yè) 麻和平 邵建寧

1.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅蘭州 730000 2.威海海洋職業(yè)學(xué)院 山東威海 264315 3.煙臺喜旺食品有限公司 山東煙臺 443000

鹵肉制品屬于低溫肉制品，因其極大程度上保留了肉品的風(fēng)味、營養(yǎng)，而且因其香鮮美味、品種繁多，深受消費者的喜愛[1]。作為一種傳統(tǒng)中式食品，鹵肉制品在國內(nèi)消費群體穩(wěn)定，市場發(fā)展空間廣闊[2]。然而，由于鹵肉制品營養(yǎng)豐富、水分活度較高，并且我國鹵肉制品的生產(chǎn)以作坊式為主，在貯藏、銷售過程中很容易被微生物污染而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[3～5]。

肉品的腐敗變質(zhì)主要是由微生物引起，有些微生物在肉中生長繁殖，生成揮發(fā)性脂肪酸、有機酸、乙酯、硫化合物、醛、酮、醇、氨等物質(zhì)，從而導(dǎo)致肉發(fā)生變色并產(chǎn)生異味，影響肉的食用；有些微生物將肉中的蛋白質(zhì)逐漸分解成脂肪酸、胺類、硫化氫、氨等低分子化合物，產(chǎn)生惡臭氣味，進而使肉發(fā)生腐敗變質(zhì)[6]。國內(nèi)外對鮮肉、高溫肉制品微生物的研究較多，而對低溫肉制品的研究則相對較少。據(jù)報道能夠引起鮮肉、高溫肉制品腐敗的微生物有乳桿菌屬、假單胞菌屬、梭菌屬、小球菌屬、變形菌屬、芽孢桿菌屬等[7]，而影響低溫肉制品質(zhì)量的微生物比較復(fù)雜，且由于肉制品配方各異，原料多樣，受不同因素如溫度、加工、包裝、有氧或無氧、貯藏方法和防腐劑等影響，會呈現(xiàn)不同腐敗微生物群[8～12]。

考慮低溫肉制品殺菌和儲存條件與鮮肉、高溫肉制品差異很大，本研究擬從市售鹵牛肉中分離引起鹵肉腐敗的細(xì)菌，并對腐敗菌進行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，已確定引起市售鹵牛肉腐敗的主要微生物，旨在為低溫肉制品的儲存、延長貨架期等問題的解決提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與處理

隔夜鹵牛肉(購自華聯(lián)超市紅星店)，將其切成薄片，稱取25g為一份，裝入包裝袋抽真空包裝，置于10℃培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于0、2、4、6、8、10、12d取樣，測定菌落總數(shù)。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

細(xì)菌染色液，革蘭氏染色；氯化鈉，分析純，天津市百世化工有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、瓊脂粉、EDTA、TRIS-HCl、十二烷基硫酸鈉SDS，北京索萊寶科技有限公司；

PCR擴增試劑盒PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，寶生物工程(大連)有限公司；

250bp DNA Ladder，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

MJ-250-1霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

LOZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；

JJ-2B型組織搗碎勻漿機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

PCR儀T100TMThermal Cycler，PowerPac Basic電泳儀；

高電流型電泳電源PowerPac HC Power Supply、凝膠成像分析系統(tǒng)Gel imaging system GelDoc XR+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；

高速臺式冷凍離心機eppendorf Centrifuge 5417R，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司；

冷凍型高通量組織破碎儀SCIENTZ-48L，寧波新芝生物科技股份有限公司；

正置生物顯微鏡，重慶澳蒲光電技術(shù)有限公司；

JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

TD4超凈工作臺，常州金壇良友儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐敗菌的培養(yǎng)

取1袋樣品，加在裝有225mL無菌生理鹽水的均質(zhì)器內(nèi)，以8 000r/min均質(zhì)1min，制成濃度為10-1的均勻稀釋液，轉(zhuǎn)至500mL三角瓶靜置。取1mL上清液進行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5等3個稀釋度，取0.2mL稀釋液涂布于培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個重復(fù)，并做空白對照，于36℃培養(yǎng)48h±2h，觀察計數(shù)。

1.4.2 腐敗菌的分離純化

從平板上挑取典型生長菌落，反復(fù)進行平板劃線分離，得到純化的單菌落，保存于試管斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 菌落及個體形態(tài)觀察

觀察各菌株單菌落的大小、形狀、邊緣結(jié)構(gòu)、顏色等，并以革蘭氏染色觀察個體形態(tài)。

1.4.4 時間對腐敗菌生長的影響

將真空包裝后的鹵牛肉置于10℃下貯藏,定時取樣,采用平板菌落計數(shù)法(36℃培養(yǎng)48h)進行細(xì)菌總數(shù)的測定，平行重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.5 菌種鑒定

將分離得到的菌株接到液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，高通量組織破碎儀充分破碎，用SDS法提取基因組DNA，電泳檢測合格后用于PCR擴增。16S rDNA的PCR擴增儀提取的DNA作為模板，采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴增目的片段的基因。

PCR反應(yīng)體系為50uL:5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10uL，正反引物各2uL，dNTP Mixture(各2.5 mM)4uL，PrimeSTAR R HS DNA Polymerase(2.5 U/uL)0.5uL，DNA模板1uL，ddH2O 30.5uL。

PCR擴增條件:98℃變性10s；56℃退火15s，72℃延伸1min30s，30個循環(huán);72℃延伸5min。將擴增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征和菌體形態(tài)

36℃培養(yǎng)2d后觀察，培養(yǎng)皿上只長了2種菌落，一種菌落大小0.3～1mm、乳白色、圓形、光滑不透明、質(zhì)地粘稠、無光澤、微隆起、邊緣整齊，編號為N1(圖1a)；另一種菌落大小1～2mm、白色、圓形、光滑、無光澤、不透明、邊緣整齊，編號為N2(圖1b)。本研究結(jié)果初步確定了這2種菌是引起本地鹵牛肉腐敗的主要微生物。

圖1 鹵牛肉中主要腐敗菌的形態(tài)圖片F(xiàn)ig. 1 Picture of main spoilage bacteria in brine beef

將2種菌進一步分離純化后，用油鏡觀察2種菌的顯微形態(tài)特征，N1(圖2a)呈短桿狀，兩端呈圓形、無芽孢；N2(圖2b)呈桿狀、無芽孢。

圖2 鹵牛肉中主要腐敗菌的顯微圖片(×1000倍)Fig. 2 Micrographs of main spoilage bacteria in brine beef

對2株菌進一步革蘭氏染色，均為陽性，2株菌的菌落及形態(tài)特征總結(jié)見表1，經(jīng)查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》根據(jù)菌落和形態(tài)特征初步判定N1為魏斯氏菌屬，N2為佐氏庫特氏菌屬。

表1 菌落特征以及形態(tài)

2.2 微生物菌落總數(shù)結(jié)果分析

鹵牛肉通常在10℃冷藏柜中出售，而在該溫度下腐敗菌生長速度的快慢關(guān)系到鹵牛肉貨架期的長短。因此，本研究選擇10℃下貯藏，分別于0、2、4、6、8、10、12d取樣，分析2種腐敗菌株隨貯藏時間的變化，分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 10℃貯藏菌落總數(shù)的變化Fig. 3 Changes of the Microbial counts stored at 10℃

結(jié)果顯示，在10℃貯藏條件下，隨著貯藏時間的增加，2株菌的菌落總數(shù)均呈現(xiàn)指數(shù)增長。當(dāng)貯藏期到達(dá)第4天時，菌落總數(shù)接近104CFU/mL。當(dāng)菌落總數(shù)高于104CFU/mL為微生物超標(biāo)商品。因此該鹵牛肉制品在10℃貯藏條件下的保質(zhì)期最多是4d。

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 菌株的PCR擴增結(jié)果

對N1和N2菌株16S r DNA序列PCR擴增后進行電泳,得到重復(fù)、穩(wěn)定、清晰的特異條帶，片段大小約1 500bp，擴增結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株的16SrDNA PCR電泳圖譜(Marker:250bp)Fig.4 PCR amplification of 16S rDNA genes(Marker:250 bp)

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析

將N1和N2菌株16S rDNA擴增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，對其進行測序分析,通過NCBI網(wǎng)站Blastn工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)選取同源性最高的菌株序列，并選取冷鮮雞肉優(yōu)勢腐敗菌Pseudomonas pseudoalcaligenes16S rRNA序列作為外類群[13]用MEGAX進行多重序列對比，并以Maximum-Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)合圖5系統(tǒng)發(fā)育樹和核酸序列比對可知，N1與魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)親緣關(guān)系為100%，N2與佐氏庫特氏菌(Kurthia zopfii)親緣關(guān)系為100%。

圖5 基于16SrRNA序列同源性的2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of 2 strains base on 16S r RNA gene analysis

3 討論

微生物生長繁殖是影響低溫肉制品貨架期的決定性因素[14]，低溫肉制品由于熱加工溫度低，導(dǎo)致產(chǎn)品中真菌孢子、細(xì)菌芽胞和部分耐熱細(xì)菌殘存，在后期的貯存和銷售過程中，那些殘存的微生物經(jīng)過短暫的適應(yīng)、修復(fù)后將重新生長繁殖，最終引發(fā)肉制品感官品質(zhì)下降、導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)、從而影響其貨架期[15～17]。同時，低溫肉制品因其肉的種類差異、組織狀態(tài)、配方成分、加工方式、包裝方式及貯藏方式的不同，容易污染的微生物的種類和數(shù)量也不同[18～20]。謝萍[21](2015)等報道散裝醬鹵鴨肉貯藏期間的致腐微生物主要是葡萄球菌、溶酪大球菌等；?，揫22](2011)等報道鎮(zhèn)江肴肉中的主要腐敗菌有熒光假單胞菌、波羅的海希瓦氏菌、解鳥氨酸拉烏爾菌；張依潔[23](2017)等報道真空包裝醬鹵鴨肉的主要優(yōu)勢腐敗菌有假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌、葡萄球菌和微球菌。本研究發(fā)現(xiàn)引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的致腐微生物是魏斯氏菌和佐氏庫特氏菌。

魏斯氏菌屬為革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称返母瘮∽冑|(zhì)[24,25]。最適生長溫度為30～37℃，不致病[26]，生存環(huán)境范圍比較廣泛，植物性材料、肉類制品以及人和動物的糞便中均可分離得到[27]。肉類加工中最常見的魏斯氏菌種類是綠色魏斯氏菌，Marta Du?ková[28](2013)等報道綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致肉制品產(chǎn)生黏液并且發(fā)綠的主要原因，黏液起初在濕潤表面的單個菌落上出現(xiàn)，不久逐漸形成一片綠色的黏液，之后從肉表面往里滲透。肉變綠的根本原因是由于形成了過氧化氫，過氧化氫能夠氧化亞硝基肌色原(肉制品的色素)，使之呈現(xiàn)綠色，這也是當(dāng)暴露于氧氣中時，各種包裝肉制品(香腸、煙熏肉、真空包裝肉)會出現(xiàn)變綠的原因[28～30]。關(guān)于魏斯氏菌，研究更多的是關(guān)于它引起肉變綠的原因與機制，而本研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌是引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌之一，當(dāng)鹵牛肉中的魏斯氏菌數(shù)量達(dá)到一定程度時，鹵牛肉便會出現(xiàn)明顯的腐敗變質(zhì)。

庫特氏菌屬為革蘭氏陽性、好氧菌，不生孢不抗酸。最適生長溫度20～35℃，不致病，廣泛分布于環(huán)境中，常見于動物糞便和肉類產(chǎn)品，可引起食品的腐敗變質(zhì)[31,32]。李除夕[33](2009)等人報道庫特氏菌被確定為引起豆腐腐敗變質(zhì)的特定腐敗微生物，而且是直接影響豆腐貨架期的因素。本研究發(fā)現(xiàn)庫特氏菌屬的模式種佐氏庫特氏菌是引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌之一，隨著貯存時間的延長，佐氏庫特氏菌增長迅速，從而導(dǎo)致產(chǎn)品細(xì)菌超標(biāo)，同時引起產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。

為了延長鹵牛肉貨架期，建議鹵牛肉生產(chǎn)者在生產(chǎn)過程中應(yīng)該對生產(chǎn)人員、加工環(huán)境進行嚴(yán)格的衛(wèi)生管理，同時對加工工藝以及包裝材料等采取有針對性的綜合控制措施，合理確定危害分析關(guān)鍵控制點，防止腐敗菌的生長繁殖，保證鹵牛肉的食用安全。另外，有些生產(chǎn)者為了延長鹵牛肉的貨架期,選擇在鹵牛肉中添加一定量的防腐劑，但是目前常用的化學(xué)合成防腐劑對人類健康存在著一定的潛在危害，隨著人們對食品安全的要求越來越高，綠色、安全、廣譜的天然防腐劑越來越受到人們的青睞，在未來的生產(chǎn)中可以考慮通過添加一定的中藥保鮮劑等生物防腐劑延長鹵牛肉的貨架期。

4 結(jié)論

本研究對貯藏在10℃條件下的真空包裝鹵牛肉中的腐敗菌進行分離純化，并通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)觀察和16S rDNA分子鑒定方法，對菌群中的特征腐敗菌進行了分離鑒定。結(jié)果表明，分離得到的2株菌魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)和佐氏庫特氏菌(Kurthia zopfii)是引起本地鹵牛肉腐敗的關(guān)鍵菌株，也是影響鹵牛肉貨架期的重要因素。本研究為鹵牛肉加工、貯藏過程中有針對性地控制微生物污染提供借鑒和參考，同時為進一步采取有效的防腐保鮮措施、延長鹵牛肉的貨架期提供了理論依據(jù)。