劉彩云 祝泉馨 方彥昊 張文齊 張建梅鄧祿印 祝 英* 王治業(yè) 麻和平 邵建寧

1.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅蘭州 730000 2.威海海洋職業(yè)學(xué)院 山東威海 264315 3.煙臺(tái)喜旺食品有限公司 山東煙臺(tái) 443000

鹵肉制品屬于低溫肉制品，因其極大程度上保留了肉品的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)，而且因其香鮮美味、品種繁多，深受消費(fèi)者的喜愛[1]。作為一種傳統(tǒng)中式食品，鹵肉制品在國(guó)內(nèi)消費(fèi)群體穩(wěn)定，市場(chǎng)發(fā)展空間廣闊[2]。然而，由于鹵肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富、水分活度較高，并且我國(guó)鹵肉制品的生產(chǎn)以作坊式為主，在貯藏、銷售過程中很容易被微生物污染而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[3～5]。

肉品的腐敗變質(zhì)主要是由微生物引起，有些微生物在肉中生長(zhǎng)繁殖，生成揮發(fā)性脂肪酸、有機(jī)酸、乙酯、硫化合物、醛、酮、醇、氨等物質(zhì)，從而導(dǎo)致肉發(fā)生變色并產(chǎn)生異味，影響肉的食用；有些微生物將肉中的蛋白質(zhì)逐漸分解成脂肪酸、胺類、硫化氫、氨等低分子化合物，產(chǎn)生惡臭氣味，進(jìn)而使肉發(fā)生腐敗變質(zhì)[6]。國(guó)內(nèi)外對(duì)鮮肉、高溫肉制品微生物的研究較多，而對(duì)低溫肉制品的研究則相對(duì)較少。據(jù)報(bào)道能夠引起鮮肉、高溫肉制品腐敗的微生物有乳桿菌屬、假單胞菌屬、梭菌屬、小球菌屬、變形菌屬、芽孢桿菌屬等[7]，而影響低溫肉制品質(zhì)量的微生物比較復(fù)雜，且由于肉制品配方各異，原料多樣，受不同因素如溫度、加工、包裝、有氧或無氧、貯藏方法和防腐劑等影響，會(huì)呈現(xiàn)不同腐敗微生物群[8～12]。

考慮低溫肉制品殺菌和儲(chǔ)存條件與鮮肉、高溫肉制品差異很大，本研究擬從市售鹵牛肉中分離引起鹵肉腐敗的細(xì)菌，并對(duì)腐敗菌進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，已確定引起市售鹵牛肉腐敗的主要微生物，旨在為低溫肉制品的儲(chǔ)存、延長(zhǎng)貨架期等問題的解決提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與處理

隔夜鹵牛肉(購(gòu)自華聯(lián)超市紅星店)，將其切成薄片，稱取25g為一份，裝入包裝袋抽真空包裝，置于10℃培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于0、2、4、6、8、10、12d取樣，測(cè)定菌落總數(shù)。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

細(xì)菌染色液，革蘭氏染色；氯化鈉，分析純，天津市百世化工有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、瓊脂粉、EDTA、TRIS-HCl、十二烷基硫酸鈉SDS，北京索萊寶科技有限公司；

PCR擴(kuò)增試劑盒PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，寶生物工程(大連)有限公司；

250bp DNA Ladder，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

MJ-250-1霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

LOZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；

JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

PCR儀T100TMThermal Cycler，PowerPac Basic電泳儀；

高電流型電泳電源PowerPac HC Power Supply、凝膠成像分析系統(tǒng)Gel imaging system GelDoc XR+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)eppendorf Centrifuge 5417R，艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司；

冷凍型高通量組織破碎儀SCIENTZ-48L，寧波新芝生物科技股份有限公司；

正置生物顯微鏡，重慶澳蒲光電技術(shù)有限公司；

JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

TD4超凈工作臺(tái)，常州金壇良友儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐敗菌的培養(yǎng)

取1袋樣品，加在裝有225mL無菌生理鹽水的均質(zhì)器內(nèi)，以8 000r/min均質(zhì)1min，制成濃度為10-1的均勻稀釋液，轉(zhuǎn)至500mL三角瓶靜置。取1mL上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5等3個(gè)稀釋度，取0.2mL稀釋液涂布于培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，并做空白對(duì)照，于36℃培養(yǎng)48h±2h，觀察計(jì)數(shù)。

1.4.2 腐敗菌的分離純化

從平板上挑取典型生長(zhǎng)菌落，反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，得到純化的單菌落，保存于試管斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 菌落及個(gè)體形態(tài)觀察

觀察各菌株單菌落的大小、形狀、邊緣結(jié)構(gòu)、顏色等，并以革蘭氏染色觀察個(gè)體形態(tài)。

1.4.4 時(shí)間對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響

將真空包裝后的鹵牛肉置于10℃下貯藏,定時(shí)取樣,采用平板菌落計(jì)數(shù)法(36℃培養(yǎng)48h)進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定，平行重復(fù)3次，取其平均值。

1.4.5 菌種鑒定

將分離得到的菌株接到液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，高通量組織破碎儀充分破碎，用SDS法提取基因組DNA，電泳檢測(cè)合格后用于PCR擴(kuò)增。16S rDNA的PCR擴(kuò)增儀提取的DNA作為模板，采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增目的片段的基因。

PCR反應(yīng)體系為50uL:5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10uL，正反引物各2uL，dNTP Mixture(各2.5 mM)4uL，PrimeSTAR R HS DNA Polymerase(2.5 U/uL)0.5uL，DNA模板1uL，ddH2O 30.5uL。

PCR擴(kuò)增條件:98℃變性10s；56℃退火15s，72℃延伸1min30s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征和菌體形態(tài)

36℃培養(yǎng)2d后觀察，培養(yǎng)皿上只長(zhǎng)了2種菌落，一種菌落大小0.3～1mm、乳白色、圓形、光滑不透明、質(zhì)地粘稠、無光澤、微隆起、邊緣整齊，編號(hào)為N1(圖1a)；另一種菌落大小1～2mm、白色、圓形、光滑、無光澤、不透明、邊緣整齊，編號(hào)為N2(圖1b)。本研究結(jié)果初步確定了這2種菌是引起本地鹵牛肉腐敗的主要微生物。

圖1 鹵牛肉中主要腐敗菌的形態(tài)圖片F(xiàn)ig. 1 Picture of main spoilage bacteria in brine beef

將2種菌進(jìn)一步分離純化后，用油鏡觀察2種菌的顯微形態(tài)特征，N1(圖2a)呈短桿狀，兩端呈圓形、無芽孢；N2(圖2b)呈桿狀、無芽孢。

圖2 鹵牛肉中主要腐敗菌的顯微圖片(×1000倍)Fig. 2 Micrographs of main spoilage bacteria in brine beef

對(duì)2株菌進(jìn)一步革蘭氏染色，均為陽(yáng)性，2株菌的菌落及形態(tài)特征總結(jié)見表1，經(jīng)查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》根據(jù)菌落和形態(tài)特征初步判定N1為魏斯氏菌屬，N2為佐氏庫(kù)特氏菌屬。

表1 菌落特征以及形態(tài)

2.2 微生物菌落總數(shù)結(jié)果分析

鹵牛肉通常在10℃冷藏柜中出售，而在該溫度下腐敗菌生長(zhǎng)速度的快慢關(guān)系到鹵牛肉貨架期的長(zhǎng)短。因此，本研究選擇10℃下貯藏，分別于0、2、4、6、8、10、12d取樣，分析2種腐敗菌株隨貯藏時(shí)間的變化，分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 10℃貯藏菌落總數(shù)的變化Fig. 3 Changes of the Microbial counts stored at 10℃

結(jié)果顯示，在10℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的增加，2株菌的菌落總數(shù)均呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)。當(dāng)貯藏期到達(dá)第4天時(shí)，菌落總數(shù)接近104CFU/mL。當(dāng)菌落總數(shù)高于104CFU/mL為微生物超標(biāo)商品。因此該鹵牛肉制品在10℃貯藏條件下的保質(zhì)期最多是4d。

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)N1和N2菌株16S r DNA序列PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳,得到重復(fù)、穩(wěn)定、清晰的特異條帶，片段大小約1 500bp，擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株的16SrDNA PCR電泳圖譜(Marker:250bp)Fig.4 PCR amplification of 16S rDNA genes(Marker:250 bp)

2.3.2 菌株的16S rDNA序列分析

將N1和N2菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析,通過NCBI網(wǎng)站Blastn工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)選取同源性最高的菌株序列，并選取冷鮮雞肉優(yōu)勢(shì)腐敗菌Pseudomonas pseudoalcaligenes16S rRNA序列作為外類群[13]用MEGAX進(jìn)行多重序列對(duì)比，并以Maximum-Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)合圖5系統(tǒng)發(fā)育樹和核酸序列比對(duì)可知，N1與魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)親緣關(guān)系為100%，N2與佐氏庫(kù)特氏菌(Kurthia zopfii)親緣關(guān)系為100%。

圖5 基于16SrRNA序列同源性的2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of 2 strains base on 16S r RNA gene analysis

3 討論

微生物生長(zhǎng)繁殖是影響低溫肉制品貨架期的決定性因素[14]，低溫肉制品由于熱加工溫度低，導(dǎo)致產(chǎn)品中真菌孢子、細(xì)菌芽胞和部分耐熱細(xì)菌殘存，在后期的貯存和銷售過程中，那些殘存的微生物經(jīng)過短暫的適應(yīng)、修復(fù)后將重新生長(zhǎng)繁殖，最終引發(fā)肉制品感官品質(zhì)下降、導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)、從而影響其貨架期[15～17]。同時(shí)，低溫肉制品因其肉的種類差異、組織狀態(tài)、配方成分、加工方式、包裝方式及貯藏方式的不同，容易污染的微生物的種類和數(shù)量也不同[18～20]。謝萍[21](2015)等報(bào)道散裝醬鹵鴨肉貯藏期間的致腐微生物主要是葡萄球菌、溶酪大球菌等；祝瑩[22](2011)等報(bào)道鎮(zhèn)江肴肉中的主要腐敗菌有熒光假單胞菌、波羅的海希瓦氏菌、解鳥氨酸拉烏爾菌；張依潔[23](2017)等報(bào)道真空包裝醬鹵鴨肉的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌有假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌、葡萄球菌和微球菌。本研究發(fā)現(xiàn)引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的致腐微生物是魏斯氏菌和佐氏庫(kù)特氏菌。

魏斯氏菌屬為革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧菌，屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称返母瘮∽冑|(zhì)[24,25]。最適生長(zhǎng)溫度為30～37℃，不致病[26]，生存環(huán)境范圍比較廣泛，植物性材料、肉類制品以及人和動(dòng)物的糞便中均可分離得到[27]。肉類加工中最常見的魏斯氏菌種類是綠色魏斯氏菌，Marta Du?ková[28](2013)等報(bào)道綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致肉制品產(chǎn)生黏液并且發(fā)綠的主要原因，黏液起初在濕潤(rùn)表面的單個(gè)菌落上出現(xiàn)，不久逐漸形成一片綠色的黏液，之后從肉表面往里滲透。肉變綠的根本原因是由于形成了過氧化氫，過氧化氫能夠氧化亞硝基肌色原(肉制品的色素)，使之呈現(xiàn)綠色，這也是當(dāng)暴露于氧氣中時(shí)，各種包裝肉制品(香腸、煙熏肉、真空包裝肉)會(huì)出現(xiàn)變綠的原因[28～30]。關(guān)于魏斯氏菌，研究更多的是關(guān)于它引起肉變綠的原因與機(jī)制，而本研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌是引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌之一，當(dāng)鹵牛肉中的魏斯氏菌數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)，鹵牛肉便會(huì)出現(xiàn)明顯的腐敗變質(zhì)。

庫(kù)特氏菌屬為革蘭氏陽(yáng)性、好氧菌，不生孢不抗酸。最適生長(zhǎng)溫度20～35℃，不致病，廣泛分布于環(huán)境中，常見于動(dòng)物糞便和肉類產(chǎn)品，可引起食品的腐敗變質(zhì)[31,32]。李除夕[33](2009)等人報(bào)道庫(kù)特氏菌被確定為引起豆腐腐敗變質(zhì)的特定腐敗微生物，而且是直接影響豆腐貨架期的因素。本研究發(fā)現(xiàn)庫(kù)特氏菌屬的模式種佐氏庫(kù)特氏菌是引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌之一，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，佐氏庫(kù)特氏菌增長(zhǎng)迅速，從而導(dǎo)致產(chǎn)品細(xì)菌超標(biāo)，同時(shí)引起產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。

為了延長(zhǎng)鹵牛肉貨架期，建議鹵牛肉生產(chǎn)者在生產(chǎn)過程中應(yīng)該對(duì)生產(chǎn)人員、加工環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格的衛(wèi)生管理，同時(shí)對(duì)加工工藝以及包裝材料等采取有針對(duì)性的綜合控制措施，合理確定危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)，防止腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，保證鹵牛肉的食用安全。另外，有些生產(chǎn)者為了延長(zhǎng)鹵牛肉的貨架期,選擇在鹵牛肉中添加一定量的防腐劑，但是目前常用的化學(xué)合成防腐劑對(duì)人類健康存在著一定的潛在危害，隨著人們對(duì)食品安全的要求越來越高，綠色、安全、廣譜的天然防腐劑越來越受到人們的青睞，在未來的生產(chǎn)中可以考慮通過添加一定的中藥保鮮劑等生物防腐劑延長(zhǎng)鹵牛肉的貨架期。

4 結(jié)論

本研究對(duì)貯藏在10℃條件下的真空包裝鹵牛肉中的腐敗菌進(jìn)行分離純化，并通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)觀察和16S rDNA分子鑒定方法，對(duì)菌群中的特征腐敗菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果表明，分離得到的2株菌魏斯氏菌(Weissella viridescens strain WM33)和佐氏庫(kù)特氏菌(Kurthia zopfii)是引起本地鹵牛肉腐敗的關(guān)鍵菌株，也是影響鹵牛肉貨架期的重要因素。本研究為鹵牛肉加工、貯藏過程中有針對(duì)性地控制微生物污染提供借鑒和參考，同時(shí)為進(jìn)一步采取有效的防腐保鮮措施、延長(zhǎng)鹵牛肉的貨架期提供了理論依據(jù)。