王益林， 文輝忠， 舒 馨， 鐘青梅， 邱子情， 黃曉霞

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧530004）

0 引 言

研究型教學(xué)實(shí)驗(yàn)將科學(xué)研究的思維方法和技能融入實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，具有綜合性、研究性和應(yīng)用性的特點(diǎn)，可培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識，提高學(xué)生運(yùn)用理論知識和實(shí)驗(yàn)技能解決具體問題的綜合能力［1-3］。目前，國內(nèi)許多高校正陸續(xù)開設(shè)并完善研究型教學(xué)實(shí)驗(yàn)［4-6］。在基礎(chǔ)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中開設(shè)研究型教學(xué)實(shí)驗(yàn)，既能提高學(xué)生學(xué)習(xí)分析化學(xué)的興趣、鍛煉實(shí)踐能力，也能培養(yǎng)學(xué)生的探索精神。為配合吸光光度法的教學(xué)，“鄰二氮菲吸光光度法測定鐵”是必做實(shí)驗(yàn)，學(xué)生對這一實(shí)驗(yàn)也很感興趣。作為一種重要的微量元素，鐵對人體健康有著較大的影響，缺鐵會影響血紅蛋白的合成，導(dǎo)致貧血癥。枸杞［7］、當(dāng)歸［8］等中草藥及黑木耳［9］、香菇［10］等食物中鐵的含量較高，具有補(bǔ)鐵功能。3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）是一種安全而靈敏的還原型顯色劑，本身無色，在辣根過氧化物酶（HRP）或金屬離子（Cu2＋、Fe3＋）［11-13］的催化作用下，可被H2O2氧化生成最大吸收波長為652 nm 的藍(lán)色電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物。近年來，以TMB為顯色劑測定過氧化苯甲酰［14］、Ag＋［15］和ClO-［16］的研究也有報道。在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，設(shè)計了利用Fe3＋氧化TMB 發(fā)生顯色反應(yīng)測定實(shí)際樣品中鐵含量的研究型教學(xué)實(shí)驗(yàn)，內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)條件的選擇、方法分析性能的評估、分析樣品的制備等完整的分析過程。該實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生鞏固基礎(chǔ)分析化學(xué)知識，了解科研工作的基本過程，培養(yǎng)學(xué)生的科研素養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

Ag＋能將無色的TMB 氧化成藍(lán)色的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物，F(xiàn)e3＋/Fe2＋和Ag＋/ Ag 兩電對的標(biāo)準(zhǔn)電極電位接近，F(xiàn)e3＋顯氧化性，也能使TMB氧化顯色，當(dāng)Fe3＋的濃度在一定范圍內(nèi)時，溶液的吸光度與Fe3＋的濃度關(guān)系服從比爾定律，可實(shí)現(xiàn)對Fe3＋的含量進(jìn)行測定。

1.2 主要試劑與儀器

NH4Fe（SO4）2·12H2O（廣東光華科技股份有限公司）；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，上海阿拉丁試劑有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司）；無水乙酸鈉（廣東光華科技股份有限公司）。以DMF為溶劑配制1.0 mmol/L TMB 溶液；Fe3＋標(biāo)準(zhǔn)溶液及其他溶液都以去離子水為溶劑配制。

UV-4802 紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司）；H1850 離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限司）；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在系列10 mL 的比色管中，依次加入4. 0 mL HAc-NaAc（pH ＝3.50）緩沖溶液、1.0 mL 1.0 mmol/L TMB溶液、1.0 mL不同濃度的Fe3＋標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水定容到刻度，充分混勻后在室溫下反應(yīng)25 min，用1 cm的比色皿在UV-4802 紫外可見分光光度計掃描其吸收光譜，并記錄652 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 機(jī)理探討

采用飽和法對Fe3＋與TMB 反應(yīng)的計量關(guān)系進(jìn)行了研究，初步探討了TMB 的顯色機(jī)理。實(shí)驗(yàn)時，固定Fe3＋的濃度，改變TMB 的濃度，得到系列［TMB］/［Fe3＋］比值不同的溶液，分別測其吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)、［TMB］/［Fe3＋］為橫坐標(biāo)作圖，如圖1 所示。由圖1 可見，當(dāng)［TMB］/［Fe3＋］的比值為2 時，在一定范圍內(nèi)繼續(xù)增大TMB的濃度，體系的吸光度保持不變，由此認(rèn)為TMB與Fe3＋反應(yīng)的計量比為2∶1。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［16］，推測TMB 與Fe3＋可能的反應(yīng)機(jī)理是在Fe3＋的作用下，TMB被氧化成藍(lán)色的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物（見圖2）。

圖1 吸光度A隨［TMB］/［Fe3 ＋］的變化關(guān)系

圖2 TMB與Fe3 ＋可能的反應(yīng)機(jī)理

2.2 測定條件的選擇

TMB的顯色反應(yīng)一般在弱酸性條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)在pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5 的HAc-NaAc緩沖溶液中，測定50 μmol/L Fe3＋和100 μmol/L TMB反應(yīng)25 min后的吸光度，以此確定發(fā)生顯色反應(yīng)的最佳pH。圖3 數(shù)據(jù)表明，當(dāng)pH ＝3.5 時，體系的吸光度值最大，因此，選擇pH ＝3.5 的HAc-NaAc緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)。

圖3 pH對體系吸光度值的影響（［Fe3 ＋］＝50 μmol/L；［TMB］＝100 μmol/L；25 min）

按實(shí)驗(yàn)方法，在pH ＝3.5 的HAc-NaAc 緩沖介質(zhì)中，測定50 μmol/L Fe3＋和100 μmol/L TMB的混合液在不同反應(yīng)時間的吸光度并確定最佳顯色時間。圖4所示數(shù)據(jù)表明，開始階段，溶液吸光度隨時間的增加而增大，顯色15 min 后繼續(xù)延長時間，吸光度保持穩(wěn)定不變，實(shí)驗(yàn)選擇在常溫下放置25 min后測吸光度。

圖4 反應(yīng)時間對體系吸光度值的影響（［Fe3 ＋］＝50 μmol/L；［TMB］＝100 μmol/L；pH ＝3.5）

2.3 方法的分析性能

當(dāng)Fe3＋離子濃度為50 μmol/L時，分別考察了濃度均為500 μmol/L的其他常見金屬離子對檢測信號的響應(yīng)情況（見圖5）。實(shí)驗(yàn)表明，K＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋等常見金屬離子因不能使TMB氧化顯色而沒有信號響應(yīng)，對Fe3＋的測定沒有干擾；但研究表明，等濃度的Ag＋和Cr6＋均產(chǎn)生干擾，不過一般植物樣品中這2 種元素的含量極少，說明方法的選擇性較好。

圖5 本方法測定Fe3 ＋離子的選擇性

按實(shí)驗(yàn)方法，測定TMB 在系列不同濃度Fe3＋溶液中的吸收光譜。結(jié)果表明，溶液吸光度隨Fe3＋濃度的升高而增大（見圖6），且Fe3＋濃度在5 ～50 μmol/L范圍內(nèi)服從比爾定律（見圖7），回歸方程為A ＝0.015 1C ＋0.012 9，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998 8，方法檢出限（3σ／k）為2.0 μmol/L。此外，從回歸方程可以得到，當(dāng)λ ＝652 nm時，摩爾吸收系數(shù)ε ＝1.51 ×104L/（mol·cm），方法的靈敏度略高于用鄰二氮菲做顯色劑的測鐵法（ε ＝1.1 ×104L/（mol·cm）），可用于溶液中微量鐵的測定。

圖6 TMB在不同濃度Fe3 ＋溶液中的吸收光譜

圖7 吸光度與Fe3 ＋濃度的線性關(guān)系

2.4 實(shí)際樣品的測定

取適量枸杞在60 ℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)烘40 min，粉碎后稱取8.00 g置于坩堝內(nèi)，在電爐上燒至完全變黑，轉(zhuǎn)移至馬弗爐內(nèi)在800 ℃下焙燒2 h。冷卻至室溫后，加入5 mL濃硝酸、1 mL濃硫酸，在電爐上緩慢加熱至沸騰，溶液變棕色，繼續(xù)加熱至冒白煙并持續(xù)2 min，溶液呈淡黃色。冷卻后7 000 r/min離心5 min，取上清液，用濃NaOH調(diào)pH至4 ～6，用去離子水定容于100 mL容量瓶內(nèi)，作為待測液。取1.0 mL 樣品待測液，按實(shí)驗(yàn)方法測定，同時做2 種濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，具體數(shù)據(jù)見表1?；厥章史謩e為104%和108%，表明方法的準(zhǔn)確度高，滿足微量分析要求。

表1 實(shí)際樣品中Fe3+含量的測定結(jié)果（n=3）

通過下式計算出樣品中鐵的含量：

式中：ρ為樣品中鐵的含量（μg/g），V為待測樣品經(jīng)消解后定容到的體積（mL），C 為實(shí)際測得的鐵含量（mol/L），m為稱取的樣品質(zhì)量（g）。經(jīng)計算，所測樣品中鐵的含量為66.5 μg/g。

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計依據(jù)學(xué)生所學(xué)分析化學(xué)理論知識并結(jié)合分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作技能，確保了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的綜合性；測定對象為大家熟悉的實(shí)際樣品，激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性。在反應(yīng)機(jī)理的探討、實(shí)驗(yàn)條件的選擇、方法分析性能的評估及分析樣品的制備與測定等一個完整的分析過程中，學(xué)生需運(yùn)用所學(xué)理論知識去解析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這樣可加深學(xué)生對分析化學(xué)基礎(chǔ)知識的理解，提高學(xué)生運(yùn)用分析化學(xué)知識解決實(shí)際問題的能力。此外，通過實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計及數(shù)據(jù)的分析和整理，學(xué)生既能從中體會到主動獲取新知的樂趣，也可提高其科研能力。此實(shí)驗(yàn)在我校部分專業(yè)已開設(shè)3 年，教學(xué)效果良好。已有3 批學(xué)生依托紫外可見分光光度計申請了大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，申請來做畢業(yè)論文的學(xué)生也明顯增多，且其中1 人獲得省級優(yōu)秀畢業(yè)論文，多人獲校級優(yōu)秀論文。3 年來，以本科生為第一作者發(fā)表SCI和EI收錄的論文各1 篇，核心期刊論文1 篇。