趙佳琦，Khattak Sameena Noor，董曉筱，胡張可，韓盧，鄧雄威，安東妮娜，胡秦，盛望

1.北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.國家納米科學中心，北京 100190；3.首都師范大學 附屬中學，北京 100037

富含未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的DNA（CpG DNA）是一種可以刺激多種免疫細胞活化或增殖，具有強烈免疫激活功能的核酸。研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的含有CpG基序的寡核苷酸序列（CpG ODN）具有相同的刺激效果[1]。Toll樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）是CpG ODN發(fā)揮免疫激活作用的受體[2-3]，主要表達在B淋巴細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和自然殺傷細胞等免疫細胞的內(nèi)吞小體膜上[4]。TLR9刺激將增強DC捕獲死亡腫瘤細胞釋放的抗原的能力，這些DC可以遷移到局部淋巴結(jié)，在那里遇到并激活腫瘤特異性細胞毒性T細胞，因此這一機制依賴于CpG ODN增強DC的活化和成熟，從而促進腫瘤抗原的攝取，進而改善隨后的免疫應答。研究表明納米化的CpG能夠在更低劑量激活免疫系統(tǒng)[5]。

近年來關于CpG的臨床試驗不斷開展，CpG既可以作為單獨藥物，也可與放療、化療[6]、免疫檢查點抑制劑[7]等聯(lián)合治療腫瘤。Hofmann等的Ⅰ期臨床試驗涉及CpG ODN腫瘤內(nèi)注射治療惡性皮膚腫瘤有較好的結(jié)果[8]；布羅迪等研究表明，腫瘤內(nèi)注射CpG（單獨或聯(lián)合放射治療）可通過提高腫瘤特異性CD8+T細胞的生成來誘導全身腫瘤消退[9]，淋巴瘤和黑色素瘤患者腫瘤內(nèi)注射CpG聯(lián)合放療通過提高腫瘤特異性CD8+T細胞發(fā)生而誘發(fā)全身腫瘤消退[10]。

β葡聚糖作為抗感染疫苗的佐劑[11]和抗癌免疫治療的免疫調(diào)節(jié)劑[12]得到了廣泛的研究。在Ⅰ期臨床試驗中，患者接種結(jié)合了β葡聚糖的神經(jīng)母細胞瘤疫苗，15名患者中有6名患者微小殘留病變消失[13]，在與生存素疫苗和DC疫苗聯(lián)合應用中也獲得了抗腫瘤效果[14-15]，但是單獨的β葡聚糖只能產(chǎn)生弱的非特異性腫瘤抑制。

本研究采用自組裝納米遞送系統(tǒng)，構(gòu)建β葡聚糖-CpG復合佐劑納米顆粒，在體外骨髓來源樹突狀細胞（dendritic cells derived from bone marrow，BMDC）及體內(nèi)黑色素瘤模型中進行抗癌研究，擬為腫瘤的免疫治療探索一種新的納米佐劑治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL/6N雌性小鼠50只（體重12～14 g，6～8周齡）購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于中國科學院過程工程研究所動物房［SYXK（京）2019-0004］，嚴格按照中國科學院過程工程研究所倫理要求進行動物實驗（IPEAECA2019016）。

B16F10細胞存儲于北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院；CpG 1826由生工生物工程（上海）有限公司合成；羧甲基β葡聚糖（carboxymethyl β-glucan，CMG）、魚精蛋白硫酸鹽（protamine sulfate，PS）購自Sigma公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素4（IL-4）購自Peprotech公司；小鼠γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒、CD11c抗體（FITC標記）、CD86抗體（PerCPCy5.5標記）、CD3抗體（FITC標記）、CD4抗體（APC標記）、CD8抗體（PE標記）購自BioLegend公司；RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、PBS（pH7.4）購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素、DNA酶購自索萊寶公司；膠原酶Ⅴ購自Sigma Aldrich公司；70 μm細胞篩網(wǎng)、EDTA抗凝管購自BD Biosciences公司；淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術(shù)有限公司；透射電鏡Tecnai G2 F30 S-TEIN（EFI公司）；動態(tài)光散射激光粒度儀（馬爾文儀器有限公司）；FACS流式細胞儀（BD公司）。

1.2 CpG納米顆粒制備

用去離子水制備1 mg/mL的羧甲基β葡聚糖溶液和1 mg/mL的魚精蛋白硫酸鹽溶液，將后者逐滴加到前者中，持續(xù)攪拌30 min后離心，去除上清液，分散，用超純水復溶，即得到葡聚糖納米顆粒（NP）。將CpG-ODN溶于上述羧甲基β葡聚糖溶液中，再按上述方法制備，即得到CpG納米顆粒（CNP）。

1.3 體外骨髓來源樹突狀細胞成熟實驗

取C57BL/6N小鼠脛骨和股骨，將完整的骨骼在70%乙醇中消毒2～5 min，PBS清洗；用RPMI-1640和直徑0.45 mm的注射器沖洗骨髓，收集骨髓細胞，靜置30 min后收集非貼壁細胞，以5×106/mL的濃度鋪6孔板，RPMI-1640培養(yǎng)基中加入20 ng/mL GM-CSF和1 ng/mL IL-4培養(yǎng)7 d；在培養(yǎng)的第3、5 d更換培養(yǎng)基，補充血清及細胞因子；第7 d收集懸浮細胞，在含20 ng/mL GMCSF、1 ng/mL IL-4的培養(yǎng)基中以1×106/mL的濃度鋪24孔板，分為5組進行處理，分別為PBS組、β葡聚糖（200 μg/mL）組、NP（β葡聚糖 200 μg/mL）組、CpG（4 μg/mL）組、CNP（CpG 4 μg/mL）組，每組3個復孔，每孔加入10 μL藥物溶液，培養(yǎng)24 h后收集細胞待用。

1.4 動物模型構(gòu)建及分組

取C57BL/6N雌性小鼠，實驗前飼養(yǎng)觀察1周。標準細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)B16F10細胞至對數(shù)期，胰酶消化后，PBS重懸調(diào)整細胞濃度為2×106/mL。小鼠右后肢皮下接種2×105/100 μL B16F10細胞，接種當天記為第0 d，接種后第6 d篩選腫瘤大小相對一致的24只小鼠，隨機分為4組進行給藥，分別為PBS（對照）組、NP（β葡聚糖2.5 mg）組、CpG（50 μg）組、CNP（CpG 50 μg，β葡聚糖2.5 mg）組，給藥體積均為100 μL，給藥方式為后頸部皮下注射，共給藥4次，給藥間隔3 d，剩余小鼠安樂死。

1.5 取材

實驗期間監(jiān)測小鼠腫瘤生長情況。測量腫瘤最大直徑（l）和最小直徑（d），用公式（l×d2）/2計算腫瘤體積。實驗結(jié)束后麻醉小鼠，眼眶取血，小鼠安樂死后分離腫瘤組織及主要內(nèi)臟器官。

1.6 ELISA檢測IFN-γ

最后一次給藥后第3 d，麻醉小鼠后眼眶取血置于EDTA抗凝管中，4000 r/min離心10 min，取上清，ELISA測定血漿中的IFN-γ含量。

1.7 腫瘤處理

分離腫瘤后立即放入PBS溶液中，將腫瘤切成小塊，轉(zhuǎn)移到含RPMI-1640、膠原酶Ⅴ（41.75 μg/mL）和DNA酶（2 μg/mL）的培養(yǎng)皿中，37℃下?lián)u晃30 min，所有與腫瘤接觸的培養(yǎng)基以及腫瘤組織都被轉(zhuǎn)移到細胞篩網(wǎng)，研磨組織，PBS沖洗收集細胞懸液，重新懸浮在淋巴細胞分離液中，分離的淋巴細胞在染色前用PBS潤洗2次。

1.8 脾臟處理

取出脾臟放入預先加入4 mL淋巴細胞分離液的平皿中，細胞篩網(wǎng)置于平皿上進行組織研磨，收集細胞懸液，緩慢加入1 mL RIPM-1640，水平離心30 min，取淋巴細胞層溶液，PBS潤洗2次，染色。

1.9 流式細胞術(shù)

用CD11c、CD86熒光抗體對DC染色，用CD3、CD8、CD4熒光抗體進行淋巴細胞染色，并用BD-FACS流式細胞儀進行分析。

1.10 統(tǒng)計學分析

用FlowJo軟件分析流式細胞結(jié)果；用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖表。組間比較采用方差分析和t檢驗，所有分析中差異的顯著性表示為*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒物理表征

如圖1所示，制備的納米顆粒形態(tài)完整，接近球形。如圖2所示，NP顆粒粒徑約為186.8 nm，包載CpG之后的納米顆粒粒徑約為201.3 nm。

2.2 體外DC成熟實驗結(jié)果

DC是功能最強的抗原提呈細胞，成熟DC能夠有效激活T細胞，誘導特異性的腫瘤毒性T淋巴細胞生成，成熟DC表面高表達黏附因子CD11c和共刺激因子CD86。體外培養(yǎng)BMDC后的實驗結(jié)果表明，除CNP外的其他實驗組對DC成熟的刺激效果無明顯差異，CNP能顯著提高DC成熟比例，約為其他實驗組的2.8倍（圖3），實驗結(jié)果還表明納米狀態(tài)的β葡聚糖并沒有表現(xiàn)出比游離葡聚糖更好的DC激活效果。

2.3 腫瘤模型小鼠腫瘤體積隨時間變化曲線

建立黑色素腫瘤模型后，4次給藥期間隔天測量腫瘤大小。生長曲線顯示CpG組、CNP組、NP組與對照組相比腫瘤體積均有減小，其中CpG組和CNP組腫瘤顯著減小，表明NP、CpG和CNP均表現(xiàn)出抗腫瘤活性，但CpG和CNP的抗腫瘤活性顯著高于NP。與CpG相比，CNP組腫瘤體積進一步減小，但本次實驗沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學顯著性差異（圖4）。

圖1 納米顆粒透射電鏡圖

圖2 納米顆粒粒徑分布

圖3 體外BMDC成熟

2.4 小鼠血漿IFN-γ含量

小鼠麻醉后眼眶取血至EDTA抗凝管中，離心取血漿，ELISA測定血漿中IFN-γ的含量，結(jié)果見圖5。NP組與對照組的IFN-γ含量沒有差異，CpG組小鼠血漿IFN-γ含量約為對照組的2.3倍，CNP組為對照組的4倍，與其他實驗組相比，IFN-γ的含量均顯著升高。

2.5 小鼠瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞百分比

處死小鼠后分離腫瘤，研磨后用淋巴細胞分離液分離瘤內(nèi)淋巴細胞，進行表面染色后，用流式細胞儀分析腫瘤組織內(nèi)浸潤性T淋巴細胞含量，結(jié)果見圖6。CpG與CNP組瘤內(nèi)的CTL細胞含量與對照組相比均明顯上升，其中復合佐劑組與單獨佐劑組相比CTL升高具有顯著性差異。CpG組瘤內(nèi)CD4+T淋巴細胞約為對照組的1.2倍，CNP組約為對照組的3.5倍，表明CNP能顯著提高腫瘤內(nèi)浸潤性淋巴細胞比例，具有更好的抗癌效果。

2.6 小鼠脾臟內(nèi)T淋巴細胞百分比

圖7結(jié)果表明，CNP組脾臟中CD4+、CD8+T淋巴細胞比例均有所上升，表明CNP給藥組小鼠的機體免疫狀態(tài)有所改善，但實驗組間并沒有顯示出顯著性的T細胞比例差異，后續(xù)須通過改變給藥劑量、增加組內(nèi)樣本數(shù)等方法進一步探究。

圖4 各組腫瘤體積

圖5 小鼠血漿中的IFN-γ含量

3 討論

隨著科學的發(fā)展和技術(shù)的進步，腫瘤診斷和治療技術(shù)都取得了很大的飛躍，腫瘤免疫療法，即利用激活病人的免疫系統(tǒng)去識別并殺死腫瘤細胞的治療手段，被視為未來腫瘤治療的重要突破口。

圖6 腫瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞比例

圖7 小鼠脾臟內(nèi)淋巴細胞比例

作為單獨的治療藥物，CpG臨床試驗全身給藥的效果較差，所以目前多為瘤內(nèi)注射[16-17]，一定程度上限制了其在實體瘤上的應用。CpG ODN與利妥昔單抗聯(lián)合治療復發(fā)/難治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者的臨床療效較好[18]，臨床前研究表明CpG ODN與anti-CTLA4或anti-PD-1結(jié)合治療可促進腫瘤的根除[19]。因此，CpG-ODN與anti-CTLA4或ant-PD-1正被考慮用于聯(lián)合治療腎、乳腺、胃腸道、卵巢、肺、皮膚等癌癥。此外，CpG納米化后作為佐劑聯(lián)合放療或單抗在臨床前研究中也取得了較好結(jié)果[20]。

本研究構(gòu)建了葡聚糖-CpG納米復合佐劑。在體外BMDC刺激成熟實驗中，CNP與CpG相比表現(xiàn)出更優(yōu)秀的激活效果，DC激活后，通過抗原提呈和分泌多種細胞因子，進一步促進體液免疫和細胞特異性免疫的發(fā)生。在小鼠體內(nèi)黑色素瘤模型中采用后頸部皮下給藥方式，與單獨CpG給藥組相比，CNP表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果，盡管統(tǒng)計學上并沒有顯著性差異，但CNP顯示出比CpG具有更強抗腫瘤活性的潛在趨勢。后續(xù)可以通過增加每組實驗鼠數(shù)量和嘗試不同劑量做進一步探究。IFN-γ作為重要的抗腫瘤細胞因子，在CNP組小鼠血漿中的含量與其他組相比顯著升高，瘤內(nèi)CD3+CD8+和CD3+CD4+T細胞浸潤也顯著增加。

綜上所述，本實驗構(gòu)建的納米復合佐劑能有效激活DC，促進DC成熟，促進后續(xù)體液及細胞免疫發(fā)生；體內(nèi)腫瘤模型中通過皮下注射全身給藥方式，納米復合佐劑表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果，能顯著提高腫瘤內(nèi)浸潤性T淋巴細胞比例，改善腫瘤微環(huán)境，為腫瘤的免疫治療提供新的納米遞送給藥方式，同時為之后佐劑與腫瘤相關性抗原共包載遞送或與單抗藥物的聯(lián)合抗癌研究提供新思路。