張?chǎng)?，宋俊科，朱曉瑜，楊海光，許啟泰，杜冠華

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，定安 571200)

神經(jīng)炎癥在腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)程中扮演重要的角色[1-4]。研究表明，抑制炎癥反應(yīng)可以有效減輕卒中造成的腦部組織損傷，減輕腦水腫[5-6]。抑制炎癥反應(yīng)同樣是預(yù)防和治療帕金森病及阿爾茨海默病的有效手段[7-8]。植物多酚具有抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)作用。多酚類化合物被認(rèn)為是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑，能夠調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、氧化還原和細(xì)胞分化等。多酚類化合物的攝入能夠?qū)股窠?jīng)元損傷，減緩疾病的進(jìn)程。對(duì)多酚類化合物的研究，有助于揭示天然小分子化合物對(duì)機(jī)體的影響和作用，同時(shí)有助于新型化合物發(fā)現(xiàn)，指導(dǎo)新藥研發(fā)。以往的研究中，對(duì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)的研究較多，但對(duì)表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)研究較少[9-10]。為了明確EGC是否具有神經(jīng)細(xì)胞改善作用，筆者應(yīng)用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，使用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，研究EGC對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 EGC購自上海源葉生物科技有限公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，胎牛血清，蛋白Marker均購自Thermo Fisher Scientific；多聚賴氨酸、LPS、Hoechst 33258、MTT均購自Sigma；一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65、β-actin、Lamin B1和Anti-rabbit IgG (H+L)，F(xiàn)(ab')2Fragment (Alexa Fluor?488 Conjugate)抗體均購自Cell Signaling Technology；BCA蛋白定量試劑盒購自普利萊；Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated和Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板均購自美國Costar；SpectraMax M5酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices；Thermo Scientific ArrayScan Infinity高內(nèi)涵分析儀購自Thermo Scientific；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad；Molecular Imager ChemiDoc XRS+ System成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5%二氧化碳(CO2)飽和濕度條件下培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.4細(xì)胞模型建立及分組 選取對(duì)數(shù)生長期BV2細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被的96孔板。建立LPS刺激細(xì)胞模型，LPS終濃度為1 μg·mL-1。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組(1 μg·mL-1LPS)，EGC小劑量組(1 μg·mL-1LPS + 5 μmol·L-1EGC)，EGC中劑量組(1 μg·mL-1LPS + 10 μmol·L-1EGC)和EGC大劑量組(1 μg·mL-1LPS + 20 μmol·L-1EGC)。

1.5細(xì)胞活力檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mg·mL-1MTT溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO100 μL，振蕩5 min，用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測(cè)定吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6NO分泌的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，每孔取上清液50 μL，再加入Griess Reagent I 50 μL，混勻，Griess Reagent II 50 μL，混勻，在波長540 nm測(cè)定A值，計(jì)算NO濃度。

1.7炎癥因子的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，吸去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.8Western blotting法檢測(cè)EGC對(duì)炎癥相關(guān)通路的影響 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入蛋白裂解液，冰上裂解細(xì)胞，提取胞漿和胞核蛋白，之后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳。然后將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA室溫封閉2 h后加入稀釋的一抗，4 ℃共孵育過夜。TBST洗滌3次，再與二抗稀釋液室溫共孵育2 h。TBST洗滌3次后顯影。

1.9免疫熒光法檢測(cè)EGC對(duì)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗1次后用4%多聚甲醛固定15 min。之后PBS洗1次，加入0.3% Triton-100孵育10 min。再用PBS洗1次，加入5% BSA溶液封閉1 h，然后加入稀釋的一抗4 ℃共孵育過夜。PBS洗3次，每次10 min，加入熒光二抗稀釋液，室溫孵育1.5 h。PBS洗3次，每次10 min，加入Hoechst，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗1次，置于高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1LPS和EGC對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力影響 結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，LPS作用于BV2細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率無顯著變化，說明1 μg·mL-1LPS對(duì)BV2細(xì)胞不存在細(xì)胞毒作用。EGC單獨(dú)作用或與LPS共同孵育BV2細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，EGC(1～100 μmol·L-1)與LPS(1 μg·mL-1)對(duì)BV2細(xì)胞無明顯毒性作用。

圖1 LPS和EGC對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響

Fig.1 Effects of LPS and EGC on the viability of BV2 cells

2.2EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞NO分泌的影響 結(jié)果見圖2。未加入刺激時(shí)BV2細(xì)胞上清液中NO含量較低，與正常對(duì)照組比較，給予LPS刺激后，NO含量顯著增加(P<0.01)。20 μmol·L-1EGC能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生(P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.EGC小劑量組；D.EGC中劑量組；E.EGC大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖2 EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞NO分泌的影響

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose EGC group；D.medium-dose EGC group；E.high-dose EGC group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01.

Fig.2 Effects of EGC on NO production in LPS-stimulated BV2 microglia cells

2.3EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響 通過ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。結(jié)果見圖3。與正常對(duì)照組比較，LPS能夠刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，其含量顯著高于正常對(duì)照組(均P<0.01)。EGC能夠顯著抑制LPS引起的BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.EGC小劑量組；D.EGC中劑量組；E.EGC大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖3 EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose EGC group；D.medium-dose EGC group；E.high-dose EGC group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05；③compared with model control group，P<0.01.

Fig.3 Effects of EGC on the production of TNF-α，IL-1β and IL-6 in LPS-stimulated BV2 microglia cells

2.4EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞中炎癥通路的影響 Western blotting和免疫熒光法對(duì)LPS刺激的BV2細(xì)胞后TLR4/MyD88信號(hào)通路的變化進(jìn)行研究。結(jié)果見圖4。與正常對(duì)照組比較，LPS刺激后，BV2細(xì)胞中TLR4和MyD88的表達(dá)水平明顯上升(均P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，EGC能明顯降低TLR4和MyD88的蛋白水平，抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路的激活。

2.5EGC抑制LPS刺激BV2細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位 進(jìn)一步采用Western blotting和免疫熒光法，對(duì)BV2細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)進(jìn)行定位。結(jié)果見圖5，LPS刺激后細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65濃度顯著升高(P<0.01)，EGC可顯著抑制LPS介導(dǎo)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。同時(shí)，EGC也能顯著抑制p-IκBα的升高，抑制炎癥反應(yīng)。

3 討論

筆者在本文通過建立LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，考察EGC對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明，EGC能夠顯著抑制炎癥反應(yīng)，并且其抗炎作用的發(fā)揮，可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

TLRs是天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子。TLRs被激活后，可以通過MyD88依賴性信號(hào)通路傳遞炎癥反應(yīng)信息，介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和釋放，產(chǎn)生炎性損傷[11-13]。NF-κB是重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，作為轉(zhuǎn)錄因子家族成員，能夠介導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6等多種炎癥介質(zhì)和生長因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[14-16]。被NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥因子進(jìn)一步反饋活化NF-κB，誘導(dǎo)NF-κB的持續(xù)性活化，從而加重炎癥損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μg·mL-1LPS和1～100 μmol·L-1EGC對(duì)BV2細(xì)胞無明顯毒性作用。而LPS刺激后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量顯著上升，20 μmol·L-1EGC能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的NO釋放。LPS刺激后TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均顯著高于正常對(duì)照組，10和20 μmol·L-1EGC能夠不同程度抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌。Western blotting和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路被激活，TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)明顯升高，而EGC能顯著降低TLR4和MyD88的表達(dá)水平，抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的核轉(zhuǎn)位，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，EGC能夠通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而減少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的分泌，降低NO釋放，從而有效抑制LPS所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.EGC小劑量組；D.EGC中劑量組；E.EGC大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖4 EGC對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞TLR4/MyD88信號(hào)通路的影響

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose EGC group；D.medium-dose EGC group；E.high-dose EGC group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05；③compared with model control group，P<0.01.

Fig.4 Effects of EGC on TLR4/MyD88 signaling pathway in LPS-stimulated BV2 microglia cells

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.EGC小劑量組；D.EGC中劑量組；E.EGC大劑量組；①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖5 EGC對(duì)LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞p-NF-κB和p-IκBα表達(dá)的影響

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose EGC group；D.medium-dose EGC group；E.high-dose EGC group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05；③compared with model control group，P<0.01.

Fig.5 Effects of EGC on p-NF-κB and p-IκBα levels in LPS-stimulated BV2 microglia cells