彭金香 吳灃 詹康 張棽 詹光杰

頭頂一顆珠(TrilliumTschonoskiiMaxim，TTM)別名為延齡草，來源于百合科，為延陵草屬，吉林延齡草的根及根莖[1]，其主要成分為皂苷[2]，主治高血壓病、月經(jīng)不調(diào)、外傷導(dǎo)致的出血等病癥。目前，頭頂一顆珠抗腫瘤作用主要集中在結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等方面[3]，專家研究發(fā)現(xiàn)頭頂一顆珠對肝有明顯的保護作用[4]。詹光杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，頭頂一顆珠有抗炎護肝的功能。宋秀三等[6]研究證明，頭頂一顆珠可促進T細胞成熟和遷移。本次實驗?zāi)康氖怯^察頭頂一顆珠正丁醇萃取物對人肝癌HepG2細胞的增殖凋亡是否存在影響，通過檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9，MMP-9)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear factor κB p65，NF-κB p65)的表達情況，試探討其在肝癌治療中的作用機制及其可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人肝癌細胞 HepG2(上?；鄯f生物科技有限公司)，5%CO2，溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 實驗藥品與試劑

頭頂一顆珠原藥材購買于恩施板橋藥材生產(chǎn)基地，經(jīng)鑒定為頭頂一顆珠。首先進行低溫60℃，干燥24小時。適量75%乙浸泡處理頭頂一顆珠藥粉1小時，回流，即得頭頂一顆珠醇提取液，減壓干燥，即乙醇提取物。隨后再用提取藥物專用水溶解，用正丁醇萃取[7]。減壓條件下，濃縮、干燥，即得頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物。測得頭頂一顆珠正丁醇萃取物總皂苷含量為14.26 mg/g。含量測定儀器是紫外分光光度計，北納創(chuàng)聯(lián)生物頭頂一顆珠為其對照品。DMEM培養(yǎng)基(SH30243.01B)，NF-κB試劑盒(Shanghai blue sky，SN368)，PCR試劑(TOYOBO)。

1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本三洋MCO-18AIC)，全波長酶標儀(美國Thermo公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，SG超純水器(德國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國RT-2100C)，超低溫冰箱(日本MDFU4086S)，紫外分光光度計(美國Beckman公司)，干燥箱(中國DZ-2BC Ⅳ), 高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，流式細胞儀(美國 Beckman公司)。

1.4 引物設(shè)計

實驗的所有基因數(shù)據(jù)都是按照 Pubmed數(shù)據(jù)庫以及β-actin基因序列為標準，均收集頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物(6 μmol/L)處理HepG2細胞48小時之后，進行檢測，以β-actin為內(nèi)參。

1.5 HepG2細胞的抑制率測定

首先將人肝癌細胞HepG2接種至96孔板，再分別用5組頭頂一顆珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96) μmol/L分別作用于HepG2，頭頂一顆珠正丁醇萃取物的空白對照組為0 μmol/L組。本次研究使用CCK8 法，對5個濃度組與其0 μmol/L的空白對照組進行比較，計算出HepG2細胞的抑制率。

1.6 MMP-9、NF-κB p65表達水平的測定

4組頭頂一顆珠正丁醇萃取物(3、6、12、24 μmol/L)分別作用于HepG2細胞48小時后，空白對照組為0 μmol/L組，用qPCR檢測MMP-9、NF-κB p65的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熒光定量結(jié)果

根據(jù)Pubmed數(shù)據(jù)庫，以及β-actin基因序列為參照,分別收集頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物(6 μmol/L)處理HepG2細胞48小時之后，以β-actin作為本次實驗的內(nèi)參，所得引物序列及其擴增片段見表1。采用Primer 5.0軟件，運用qPCR檢測，其引物擴增曲線、引物熔解曲線見圖1。從表1發(fā)現(xiàn)MMP-9、NF-κB p65、β-actin表達情況較好，圖1顯示MMP-9、NF-κB p65、β-actin的溶解曲線都是單峰，反應(yīng)擴增產(chǎn)物單一，引物有很強的特異性，即確定為目標產(chǎn)物。

表1 PCR引物序列

2.2 CCK-8檢測頭頂一顆珠正丁醇萃取物對肝癌HepG2細胞抑制情況

不同濃度的頭頂一顆珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96)μmol/L作用于HepG2細胞不同時間，與0 μmol/L的頭頂一顆珠正丁醇萃取物進行比較，證明HepG2細胞生長增殖情況均受到不同濃度的頭頂一顆珠明顯抑制(P<0.01)。在其中同一時間點，隨著藥物濃度的不斷增加，HepG2細胞抑制率呈劑量的相關(guān)性，即頭頂一顆珠藥物濃度越高，頭頂一顆珠對HepG2細胞抑制率越高，其抑制率且與濃度及時間呈依賴性。見表2。

2.3 qPCR檢測MMP-9、NF-κB p65的表達水平

與0 μmol/L的頭頂一顆珠正丁醇萃取物比較，MMP-9、NF-κB p65均明顯降低(P<0.01)，并且隨著頭頂一顆珠正丁醇萃取物濃度的增加，MMP-9、NF-κB p65的表達水平不斷降低(P<0.05)，表明頭頂一顆珠正丁醇萃取物能顯著抑制MMP-9、NF-κB p65表達及活性，且呈劑量依賴性。見表3。

注：A：β-actin的擴增曲線；B：β-actin的溶解曲線；C：MMP-9的擴增曲線；D：MMP-9的溶解曲線；E：NF-κB p65的擴增曲線；F：NF-κB p65的溶解曲線。

圖1 內(nèi)參基因及目的基因擴增曲線和溶解曲線

表2 多濃度頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理 HepG2細胞后的抑制率情況比較

注： 同一作用時間下，與前一濃度組比較，P均<0.05。

表3 多濃度頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理HepG2后 MMP-9、NF-κB p65表達水平檢測結(jié)果比較

注： 與0 μmol/L比較，P均<0.05；后濃度組與前濃度組比較，P均<0.05。

3 討論

NF-κB信號通路在原發(fā)性肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[8]。當NF-κB在某種條件下被激活以后，NF-κB通路常在體內(nèi)以p65 的形式存在，它將參與到許多基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。MMPs在各種腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移一系列過程中，發(fā)揮特別關(guān)鍵的功能。MMP-9是MMPs蛋白家族最重要的膠原酶之一，MMP-9與多種腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移有著不可分割的聯(lián)系。

目前研究發(fā)現(xiàn)MMP-9存在于肝癌的表達中，還跟各種腫瘤有著侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系[9]。TANG 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞組織的14-3-3β蛋白，其表達會激活NF-κB信號通路，進而上調(diào)MMP-9的表達。CHEN 等[11]研究表明，遷移和入侵是各種腫瘤轉(zhuǎn)移的主要特征，MMP-9在各種癌癥的侵襲、擴散、轉(zhuǎn)移過程中，扮演重要的角色，主要是抑制NF-κB信號通路。還有研究證明，NF-κB是調(diào)節(jié)MMP-9表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)MMP-9的表達。這些效應(yīng)促進肝癌細胞對細胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致肝癌細胞不斷向四周侵襲與轉(zhuǎn)移。

本次結(jié)果證明，頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理的HepG2細胞被抑制增殖，其抑制率跟細胞培養(yǎng)時間和藥物濃度呈依賴性。5種不同濃度均能顯著抑制兩種基因的表達水平，隨頭頂一顆珠提取物濃度不斷增大，兩種基因的表達水平不斷降低。目前，對于MMP-9在肝癌方面的研究比較局限，機制也不是很明確；還需要進一步的研究和探討。本次實驗存在的不足：未觀察細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比值，沒有分析頭頂一顆珠正丁醇。下一步需要重點研究抑制HepG2細胞增殖的機制，并對NF-κB p65與MMP-9 mRNA之間關(guān)系的進行深層次研究。