彭金香 吳灃 詹康 張棽 詹光杰

頭頂一顆珠(TrilliumTschonoskiiMaxim，TTM)別名為延齡草，來(lái)源于百合科，為延陵草屬，吉林延齡草的根及根莖[1]，其主要成分為皂苷[2]，主治高血壓病、月經(jīng)不調(diào)、外傷導(dǎo)致的出血等病癥。目前，頭頂一顆珠抗腫瘤作用主要集中在結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等方面[3]，專家研究發(fā)現(xiàn)頭頂一顆珠對(duì)肝有明顯的保護(hù)作用[4]。詹光杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，頭頂一顆珠有抗炎護(hù)肝的功能。宋秀三等[6]研究證明，頭頂一顆珠可促進(jìn)T細(xì)胞成熟和遷移。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察頭頂一顆珠正丁醇萃取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖凋亡是否存在影響，通過(guò)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinases-9，MMP-9)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear factor κB p65，NF-κB p65)的表達(dá)情況，試探討其在肝癌治療中的作用機(jī)制及其可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞 HepG2(上?；鄯f生物科技有限公司)，5%CO2，溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

頭頂一顆珠原藥材購(gòu)買于恩施板橋藥材生產(chǎn)基地，經(jīng)鑒定為頭頂一顆珠。首先進(jìn)行低溫60℃，干燥24小時(shí)。適量75%乙浸泡處理頭頂一顆珠藥粉1小時(shí)，回流，即得頭頂一顆珠醇提取液，減壓干燥，即乙醇提取物。隨后再用提取藥物專用水溶解，用正丁醇萃取[7]。減壓條件下，濃縮、干燥，即得頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物。測(cè)得頭頂一顆珠正丁醇萃取物總皂苷含量為14.26 mg/g。含量測(cè)定儀器是紫外分光光度計(jì)，北納創(chuàng)聯(lián)生物頭頂一顆珠為其對(duì)照品。DMEM培養(yǎng)基(SH30243.01B)，NF-κB試劑盒(Shanghai blue sky，SN368)，PCR試劑(TOYOBO)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本三洋MCO-18AIC)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，SG超純水器(德國(guó))，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)RT-2100C)，超低溫冰箱(日本MDFU4086S)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)，干燥箱(中國(guó)DZ-2BC Ⅳ), 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman公司)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)的所有基因數(shù)據(jù)都是按照 Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)以及β-actin基因序列為標(biāo)準(zhǔn)，均收集頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物(6 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞48小時(shí)之后，進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參。

1.5 HepG2細(xì)胞的抑制率測(cè)定

首先將人肝癌細(xì)胞HepG2接種至96孔板，再分別用5組頭頂一顆珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96) μmol/L分別作用于HepG2，頭頂一顆珠正丁醇萃取物的空白對(duì)照組為0 μmol/L組。本次研究使用CCK8 法，對(duì)5個(gè)濃度組與其0 μmol/L的空白對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算出HepG2細(xì)胞的抑制率。

1.6 MMP-9、NF-κB p65表達(dá)水平的測(cè)定

4組頭頂一顆珠正丁醇萃取物(3、6、12、24 μmol/L)分別作用于HepG2細(xì)胞48小時(shí)后，空白對(duì)照組為0 μmol/L組，用qPCR檢測(cè)MMP-9、NF-κB p65的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熒光定量結(jié)果

根據(jù)Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)，以及β-actin基因序列為參照,分別收集頭頂一顆珠原藥材正丁醇萃取物(6 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞48小時(shí)之后，以β-actin作為本次實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，所得引物序列及其擴(kuò)增片段見表1。采用Primer 5.0軟件，運(yùn)用qPCR檢測(cè)，其引物擴(kuò)增曲線、引物熔解曲線見圖1。從表1發(fā)現(xiàn)MMP-9、NF-κB p65、β-actin表達(dá)情況較好，圖1顯示MMP-9、NF-κB p65、β-actin的溶解曲線都是單峰，反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物有很強(qiáng)的特異性，即確定為目標(biāo)產(chǎn)物。

表1 PCR引物序列

2.2 CCK-8檢測(cè)頭頂一顆珠正丁醇萃取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制情況

不同濃度的頭頂一顆珠正丁醇萃取物(6、12、24、48、96)μmol/L作用于HepG2細(xì)胞不同時(shí)間，與0 μmol/L的頭頂一顆珠正丁醇萃取物進(jìn)行比較，證明HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況均受到不同濃度的頭頂一顆珠明顯抑制(P<0.01)。在其中同一時(shí)間點(diǎn)，隨著藥物濃度的不斷增加，HepG2細(xì)胞抑制率呈劑量的相關(guān)性，即頭頂一顆珠藥物濃度越高，頭頂一顆珠對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率越高，其抑制率且與濃度及時(shí)間呈依賴性。見表2。

2.3 qPCR檢測(cè)MMP-9、NF-κB p65的表達(dá)水平

與0 μmol/L的頭頂一顆珠正丁醇萃取物比較，MMP-9、NF-κB p65均明顯降低(P<0.01)，并且隨著頭頂一顆珠正丁醇萃取物濃度的增加，MMP-9、NF-κB p65的表達(dá)水平不斷降低(P<0.05)，表明頭頂一顆珠正丁醇萃取物能顯著抑制MMP-9、NF-κB p65表達(dá)及活性，且呈劑量依賴性。見表3。

注：A：β-actin的擴(kuò)增曲線；B：β-actin的溶解曲線；C：MMP-9的擴(kuò)增曲線；D：MMP-9的溶解曲線；E：NF-κB p65的擴(kuò)增曲線；F：NF-κB p65的溶解曲線。

圖1 內(nèi)參基因及目的基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線

表2 多濃度頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理 HepG2細(xì)胞后的抑制率情況比較

注： 同一作用時(shí)間下，與前一濃度組比較，P均<0.05。

表3 多濃度頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理HepG2后 MMP-9、NF-κB p65表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果比較

注： 與0 μmol/L比較，P均<0.05；后濃度組與前濃度組比較，P均<0.05。

3 討論

NF-κB信號(hào)通路在原發(fā)性肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[8]。當(dāng)NF-κB在某種條件下被激活以后，NF-κB通路常在體內(nèi)以p65 的形式存在，它將參與到許多基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。MMPs在各種腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移一系列過(guò)程中，發(fā)揮特別關(guān)鍵的功能。MMP-9是MMPs蛋白家族最重要的膠原酶之一，MMP-9與多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移有著不可分割的聯(lián)系。

目前研究發(fā)現(xiàn)MMP-9存在于肝癌的表達(dá)中，還跟各種腫瘤有著侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系[9]。TANG 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞組織的14-3-3β蛋白，其表達(dá)會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)MMP-9的表達(dá)。CHEN 等[11]研究表明，遷移和入侵是各種腫瘤轉(zhuǎn)移的主要特征，MMP-9在各種癌癥的侵襲、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，扮演重要的角色，主要是抑制NF-κB信號(hào)通路。還有研究證明，NF-κB是調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)MMP-9的表達(dá)。這些效應(yīng)促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞不斷向四周侵襲與轉(zhuǎn)移。

本次結(jié)果證明，頭頂一顆珠正丁醇萃取物處理的HepG2細(xì)胞被抑制增殖，其抑制率跟細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和藥物濃度呈依賴性。5種不同濃度均能顯著抑制兩種基因的表達(dá)水平，隨頭頂一顆珠提取物濃度不斷增大，兩種基因的表達(dá)水平不斷降低。目前，對(duì)于MMP-9在肝癌方面的研究比較局限，機(jī)制也不是很明確；還需要進(jìn)一步的研究和探討。本次實(shí)驗(yàn)存在的不足：未觀察細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比值，沒有分析頭頂一顆珠正丁醇。下一步需要重點(diǎn)研究抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制，并對(duì)NF-κB p65與MMP-9 mRNA之間關(guān)系的進(jìn)行深層次研究。