黃帥陽 吳藝瓊 鞏卓彥 王亞晗 瑪娜璐璐 劉珍洪 秦高鳳 王蓬文

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是以認(rèn)知功能障礙和大腦萎縮為主要特征，且以突觸和神經(jīng)元丟失、大量β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)沉積為主要的神經(jīng)病理學(xué)病變[1]。在AD中、晚期神經(jīng)病理學(xué)和形態(tài)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)和海馬許多區(qū)域都存在明顯的突觸缺失，但許多早期患者的突觸數(shù)量并沒有明顯減少，這些病人只表現(xiàn)出突觸結(jié)構(gòu)改變和功能障礙[2-3]。突觸效能的改變可能發(fā)生在突觸喪失之前，而這種改變主要取決于突觸后谷氨酸受體數(shù)量的改變，同時伴隨著樹突棘和突觸后密度(post-synaptic density，PSD)區(qū)域的擴大或縮小[4]。PSD是指含有N-甲基-D-天冬氨酸受體和亞型谷氨酸受體、PSD蛋白如PSD95和Shank1等的電子致密增厚物[5]。突觸上谷氨酸受體的數(shù)量是決定突觸效能的主要因素之一，它可以估計突觸興奮性突觸后電流的大小。此外，PSD蛋白有助于解釋突觸的功能和區(qū)域結(jié)構(gòu)以及它們在突觸可塑性中的可能作用[6]。

中醫(yī)藥復(fù)方具有多靶點的特點，并在治療SAD發(fā)揮了重要的作用。中醫(yī)藥復(fù)方金思維(以下簡稱“金思維”)是由人參、肉蓯蓉、石菖蒲、熟地黃、茯苓等藥物煎煮混合而成，具有補腎陽虛、豁痰開竅之效，金思維在臨床應(yīng)用也顯示出顯著的療效。臨床研究取75例輕度認(rèn)知損害患者(mild cognitive impairment，MCI)進行1年的隨訪，發(fā)現(xiàn)金思維觀察組簡易智能精神狀態(tài)檢查量表(mini-mental state examination，MMSE)的分值和詞語記憶積分與安慰組都存在明顯差異，表明金思維對老年MCI患者的記憶衰退具有良好的改善作用[7]。實驗研究也同時發(fā)現(xiàn)金思維提取物在APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠大腦淀粉樣斑塊形成前后均有激活鈣調(diào)蛋白依賴性激酶的表達和抑制鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白磷酸酶2B表達的作用，可能在一定程度上緩解AD神經(jīng)元突觸功能障礙[8]。然而，金思維在AD早期的具體治療靶點仍不清楚。這些發(fā)現(xiàn)促使我們研究金思維對AD突觸的作用機制。本研究采用雙側(cè)側(cè)腦室注射STZ為擬SAD小鼠模型，通過觀察海馬CA1區(qū)突觸相關(guān)蛋白PSD95和Shank1的表達，研究金思維對突觸的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡SPF級C57/BL6J雄性小鼠72只，體重22～25 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室[SYXK(京)2015-0001]，實驗期間動物自由飲水、攝食。本實驗經(jīng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)實驗進行(倫理號:16-21)。

1.2 試劑及儀器

金思維免煎顆粒劑(本品各中藥比例人參為4.4%、蓯蓉17.3%、地黃17.3%、遠(yuǎn)志13%、石菖蒲13%、姜黃13%、茯苓13%、丹參9%)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制備[8]。鹽酸多奈哌齊由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供(批號140635)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(貨號S0130)由美國Sigma公司生產(chǎn)；一抗鼠抗小鼠β-actin抗體(貨號ab3280，Western blot 1∶1000)、兔抗小鼠PSD95抗體(貨號ab18258，Western blot 1∶500；免疫組化1∶1000)、兔抗小鼠Shank1抗體(貨號ab154224，Western blot 1∶1000,免疫組化1∶1000)均由Abcam公司提供。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒；5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)；ECL超敏發(fā)光液；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sod.dodecyl sulfate，SDS)、Tris base、無水甲醇等常規(guī)試劑購買自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。BCA法蛋白濃度定量試劑盒(貨號C-0018)，購于北京博奧森生物技術(shù)有取公司。兔二步法檢測試劑盒(貨號PV-9001)、DAB試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。儀器YLS-3TB跳臺記錄儀購自濟南益延科技發(fā)展有限公司；Mini-PROTEAN3電泳儀由美國BIORAD公司購買。

1.3 擬SAD小鼠模型制備和分組

擬SAD造模：隨機取C57/BL6J小鼠60只于第1和第3天雙側(cè)側(cè)腦室注射STZ(人工腦脊液配制，濃度6 mg/mL，3 mg/kg)。前囟后0.8 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處用牙科鉆顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自表面垂直進針2 mm，緩慢注入5 μL液體(注射時間為5分鐘)，注射完畢縫合切口[9]。

分組及給藥：將60只擬SAD模型小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分為5組：模型組(0.5%CMC)、多奈哌齊組(0.92 mg·kg-1·d-1)及金思維大、中、小劑量組(20、10、5 mg·kg-1·d-1)，每組12只。另取12只C57/BL6J小鼠于第1和第3天雙側(cè)側(cè)腦室注射等體積人工腦脊液，作為對照組(0.5%CMC)。所有小鼠連續(xù)灌胃3個月(0.1 mL/10 g)，1次/日。

1.4 擬SAD小鼠跳臺實驗檢測

末次灌胃結(jié)束后進行跳臺檢測。YLS-3TB跳臺記錄儀是被黑色塑料板分隔為5個方形空間的密閉長方體，每個方形空間中心是一個絕緣性高站臺，其黑箱底部鋪以可通電流的銅柵。第1天為訓(xùn)練期，先將小鼠放入跳臺箱內(nèi)適應(yīng)3分鐘，接通底部銅柵交流電訓(xùn)練5分鐘。第2天為試驗期，將小鼠再次放在平臺上，底部銅柵通交流電后，記錄5分鐘內(nèi)小鼠第一次從平臺跳下所需的時間(即跳臺潛伏期)，并以時間單位秒(s)記錄，以此反映小鼠記憶獲得和保持能力。

1.5 擬SAD小鼠海馬PSD95和Shank1的Western blot檢測

每組各取6只小鼠麻醉后斷頭處死，然后立即置于冰浴上剝離小鼠大腦海馬組織，用生理鹽水沖洗凈后置于-180℃液氮罐中儲存?zhèn)溆茫∧X組織進行海馬蛋白提取和BCA濃度測定。將海馬置于EP管中，加入RIPA組織/細(xì)胞裂解液，利用超聲粉碎機勻漿之后進行離心，獲得上清液。配置BCA工作液，對海馬組織進行濃度測定。按照制備SDS-PAGE膠、蛋白質(zhì)加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)、顯色、曝光的步驟進行操作。最后通過Image J軟件對Western-blot所測蛋白條帶進行分析，用內(nèi)參β-actin的灰度值作為比較，對結(jié)果進行分析并計算相對百分?jǐn)?shù)，即(ID/內(nèi)參ID)×100%。

1.6 擬SAD小鼠海馬CA1區(qū)PSD95和Shank1免疫組化檢測

每組另外取6只小鼠灌注取材作免疫組織化學(xué)染色，將固定的腦組織進行冠狀面取材、脫水、石蠟包埋、切片[5]。將小鼠海馬CA1區(qū)制成厚度約為4 μm的連續(xù)冠狀切片，然后對切片進行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、兔二步法試劑檢測、封閉、抗體反應(yīng)、DAB顯色、脫水透明、封片。最后在20倍物鏡下選擇3個視野觀察海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)取平均值并與其他組陽性細(xì)胞數(shù)作比較分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠跳臺測試結(jié)果

在行為學(xué)跳臺測試中，模型組小鼠潛伏期時間與對照組相比顯著降低(P<0.01)，模型組小鼠記憶獲得能力較差，對第1天的訓(xùn)練不能進行很好的記憶保持。多奈哌齊組和金思維小劑量組與模型組相比潛伏期時間顯著增長(P<0.01)，金思維大、中劑量組對比模型組潛伏期時間也有不同程度的增長(P<0.05)，這表明金思維干預(yù)都不同程度的增強了小鼠的記憶獲得能力，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠跳臺潛伏期結(jié)果比較

注： 與對照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 各組小鼠海馬PSD95和Shank1的Western blot檢測

與對照組相比，模型組小鼠海馬PSD95蛋白(P<0.01)和Shank1(P<0.05)蛋白表達條帶明顯變細(xì)且顏色變淺；多奈哌齊組與模型組相比，PSD95和Shank1蛋白表達條帶增寬，顏色加深(P<0.05)；PSD95檢測中金思維大、中劑量組較于模型組蛋白條帶稍增粗，顏色略深；Shank1條帶檢測中金思維中劑量組(P<0.05)、小劑量組(P<0.01)相較于模型組都有不同程度的增粗和加深。結(jié)果見表2、圖1。

表2 各組小鼠海馬PSD95和Shank1 蛋白表達比較只)

注： 與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01。

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖1 各組小鼠海馬PSD95和Shank1蛋白免疫印跡檢測

2.3 各組小鼠海馬CA1區(qū)PSD95和Shank1免疫組化檢測

小鼠海馬CA1區(qū)PSD95和Shank1陽性細(xì)胞棕黃色，細(xì)胞形狀多為橢圓形或圓形。模型組與對照組相比，海馬CA1區(qū)PSD95和Shank1的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少、染色變淺(P<0.01)；與模型組相比，多奈哌齊組、金思維大劑量組和中劑量組的PSD95陽性細(xì)胞數(shù)都略增多(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組中Shank1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，金思維中、小劑量組的Shank1陽性細(xì)胞數(shù)略增多(P<0.05)，結(jié)果見表3，圖2、3。

表3 各組小鼠海馬CA1區(qū)PSD95和Shank1 陽性細(xì)胞數(shù)比較只)

注：與對照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

在AD的研究中，突觸被認(rèn)為是最早的病理部位，突觸的變化和丟失是認(rèn)知損傷重要的病理相關(guān)[10]。早期記憶喪失源于神經(jīng)元死亡前的突觸功能衰竭，而突觸功能衰竭源于Aβ寡聚體(Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs)而非神經(jīng)元纖維纏結(jié)[11]。PSD是興奮性突觸樹突狀棘內(nèi)的一個局部密集區(qū)域，由突觸可塑性相關(guān)的受體、激酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號分子組成。PSD95是神經(jīng)發(fā)育過程中參與谷氨酸能傳遞、突觸可塑性和樹突狀形態(tài)形成的重要成分。因此，PSD95在發(fā)育過程中的功能障礙可能會改變樹突棘上的突觸可塑性發(fā)生，而這些突觸可塑性的發(fā)生會導(dǎo)致與神經(jīng)疾病相關(guān)的突觸畸形改變[12]。實驗數(shù)據(jù)表明這些ADDLs與神經(jīng)元表面結(jié)合，且90%的結(jié)合位點與突觸標(biāo)記物PSD95共定位；同時Aβ42的神經(jīng)毒性可以誘發(fā)PSD95蛋白表達的下調(diào)，進而影響突觸可塑性，并導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力受損[13]。

Shank蛋白是PSD中谷氨酸受體的組織者，由Shank1、Shank2和Shank3三個基因編碼[14]，在神經(jīng)發(fā)育和認(rèn)知中起重要作用。其中Shank1在正常突觸結(jié)構(gòu)和信號傳導(dǎo)中起著重要作用，包括突觸長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)作用，這些過程被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶形成的基礎(chǔ)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)Shank1敲除小鼠表現(xiàn)出樹突棘密度降低，樹突棘表型不成熟，在行為學(xué)測試中表現(xiàn)認(rèn)知障礙[17]。這些研究都表明適當(dāng)調(diào)控Shank1對于正常的突觸結(jié)構(gòu)和認(rèn)知至關(guān)重要。在AD中，突觸損傷的過程可能始于突觸相關(guān)蛋白的失調(diào)，如PSD95和Shank1[18]。然而，海馬體作為大腦重要區(qū)域之一，被一致認(rèn)為參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能，尚不確定Shank1在海馬體中的發(fā)育表達。本研究的目的是在AD早期檢測海馬CA1中Shank1的表達，以確定正常海馬發(fā)育與Shank1表達的關(guān)系。

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)PSD95表達對比(免疫組化×20，標(biāo)尺=50μm)

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)Shank1表達對比(免疫組化×20，標(biāo)尺=50μm)

STZ是一種亞硝基脲衍生物，在中樞可以阻斷胰島素受體引起腦源性胰島素抵抗，從而使胰島素信號傳導(dǎo)障礙和氧化代謝下降[19]。已證實小劑量STZ雙側(cè)側(cè)腦室隔日注射可以引起小鼠腦內(nèi)持久的葡萄糖代謝紊亂和能量生成障礙，進一步引起高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ表達增加，Aβ聚集成ADDLs，并可釋放和結(jié)合到特殊位點，影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能蛋白的表達，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和突觸可塑性，造成記憶丟失，常被作為擬SAD的動物模型應(yīng)用[20]。

前期課題組研究發(fā)現(xiàn)用金思維干預(yù)治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，可以明顯改善AD小鼠在行為學(xué)水迷宮和跳臺檢測中的表現(xiàn)，電鏡下觀察AD小鼠海馬的病理切片也發(fā)現(xiàn)金思維干預(yù)治療組與模型組有顯著差異，神經(jīng)元、突觸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)較模型組都有明顯改善[21]。在東莨菪堿致記憶障礙小鼠模型中，金思維可以提高模型組小鼠在水迷宮中的定向航行和空間探索能力，可使模型組小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿含量升高、乙酰膽堿酯酶活性下降和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性升高[22]。為了進一步評價金思維的作用和探究金思維對AD小鼠海馬突觸保護作用機制，課題組使用STZ雙側(cè)側(cè)腦室隔日注射擬SAD模型進行了本次實驗研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠海馬PSD95和Shank1表達均降低，藥物組金思維的干預(yù)都不同程度的增加了PSD95和Shank1蛋白的表達。免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示一致，金思維給藥組較于模型組小鼠海馬CA1區(qū)的PSD95和Shank1的陽性細(xì)胞表達數(shù)量明顯增加且染色深度不同程度的加深。這些結(jié)果表明金思維提高了SAD記憶獲得能力，且可能是通過調(diào)節(jié)海馬突觸相關(guān)蛋白PSD95和Shank1來改善突觸效能，從而發(fā)揮保護AD作用。