孫青 薛曉偉 閆斌 田國(guó)慶 梁曉春

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。近年來(lái)，胰島素抵抗和肥胖在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)發(fā)病機(jī)制中的作用受到關(guān)注[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)成人T1DM患者NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[4-5]；研究證實(shí)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)T1DM大鼠可見(jiàn)肝臟脂肪變性[6-7]，其具體機(jī)制尚不清楚，缺乏有效治療方法。本研究擬初步探索中藥復(fù)方筋脈通對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟損傷和脂肪變性等表型的保護(hù)作用，為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

6～8周齡雄性SD大鼠，體重180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，維持飼料喂養(yǎng)，進(jìn)食、飲水不限。筋脈通膠囊為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑，由菟絲子10 g、女貞子10 g、水蛭3 g、延胡索10 g、桂枝10 g、細(xì)辛3 g等組成，每粒含生藥0.35 g，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)(批號(hào)120119)。STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；血糖儀購(gòu)自美國(guó)Abbott公司；蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)液購(gòu)自北京九州柏林生物科技有限公司；Masson三色染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分正常對(duì)照組和糖尿病組和筋脈通組，每組各8只。造模前禁食過(guò)夜，正常對(duì)照組注射等量的枸櫞酸鹽緩沖液，糖尿病組和筋脈通組一次性腹腔注射1%STZ 55 mg/kg(0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液配制，pH 4.5)。72小時(shí)后用血糖儀測(cè)定尾尖血糖，正常對(duì)照組大鼠血糖<7.0 mmol/L，糖尿病組和筋脈通組大鼠血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，筋脈通組按成人劑量10倍(0.876 g·kg-1·d-1)灌胃，每日1次，糖尿病組和筋脈通組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃12周，每4周監(jiān)測(cè)血糖、體重。

1.3 組織取材

灌胃12周后禁食過(guò)夜，次日空腹測(cè)量體重，予12%烏拉坦腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈取血，離心取血清并分裝，-80℃保存，用于檢測(cè)肝功、血脂。仰臥位固定，開(kāi)腹取肝臟，稱(chēng)重后置于冰上，切取部分肝組織置于10%中性福爾馬林緩沖液固定，用于常規(guī)石蠟包埋和病理切片。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

肝/體重的比值、肝功、血脂用肝臟重量除以體重以計(jì)算肝/體重的比值，采用乳酸脫氫酶法檢測(cè)大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)表達(dá)，酶法測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平。

1.5 HE染色

每組隨機(jī)選擇6只大鼠的樣本進(jìn)行HE染色。對(duì)各組的肝組織樣本進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀掃描后利用NDP.view軟件導(dǎo)出圖片，觀察肝組織的病理學(xué)改變。由病理學(xué)專(zhuān)家讀片判定NAFLD活動(dòng)評(píng)分(NAFLD activity score, NAS)。NAS評(píng)分(0～8分)：(1)肝細(xì)胞脂肪變：0分(<5%),1分(5%～33%),2分(34%～66%),3分(>66%)；(2)小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)：0分(無(wú)),1分(<2個(gè)),2分(2～4個(gè)),3分(>4個(gè))；(3)肝細(xì)胞氣球樣變：0分(無(wú)),1分(少見(jiàn)),2分(多見(jiàn))[8]。

1.6 Masson染色

每組隨機(jī)選擇6只大鼠的樣本進(jìn)行Masson染色。切片常規(guī)脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色10分鐘，酸性乙醇分化液分化，Masson藍(lán)化液返藍(lán)；麗春紅品紅染色5分鐘，磷鉬酸溶液分化；苯胺藍(lán)溶液染色10分鐘，弱酸工作液浸泡沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。掃描切片后導(dǎo)出圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血糖、體重結(jié)果

造模后各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，自第4周起糖尿病組和筋脈通組大鼠體重較正常對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，糖尿病組和筋脈通組間差異不顯著(P>0.05)。造模后糖尿病組和筋脈通組大鼠血糖與正常對(duì)照組比較顯著升高(P<0.01)，并持續(xù)至第12周，糖尿病組和筋脈通組間血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)[9]。

2.2 血脂、肝/體重比值、肝功能、血脂結(jié)果

灌胃12周后，各組大鼠血清TC水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而糖尿病組大鼠血清TG和FFA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，筋脈通組大鼠TG、FFA水平較糖尿病組大鼠均明顯降低(P<0.05)，可見(jiàn)筋脈通可改善TG和FFA異常。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 灌胃12周后各組大鼠血清中TC、TG、FFA 的表達(dá)情況

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與糖尿病組比較，bP<0.05。

灌胃12周后，糖尿病組和筋脈通組大鼠的肝/體重的比值較正常對(duì)照組均顯著升高，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。肝功能方面，糖尿病組大鼠血清ALT和AST表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與糖尿病組相比，筋脈通組大鼠血清ALT、AST水平顯著降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 灌胃12周后各組大鼠肝/體重比值、ALT、AST 的表達(dá)情況

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與糖尿病組比較，bP<0.05。

2.3 HE染色結(jié)果

形態(tài)方面，正常對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，中央靜脈大而壁薄，細(xì)胞形態(tài)正常；糖尿病組可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，以小泡性脂肪變?yōu)橹?，但未?jiàn)明顯的肝細(xì)胞氣球樣變；肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)壞死灶。筋脈通組肝細(xì)胞脂肪變的面積、程度和炎性浸潤(rùn)等情況均明顯優(yōu)于糖尿病組。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 脂肪變性評(píng)分、炎癥評(píng)分、NAS評(píng)分結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，糖尿病組的脂肪變性評(píng)分和炎癥評(píng)分均顯著升高(P<0.05)，未見(jiàn)明顯的氣球樣變。與糖尿病組比較，筋脈通組的脂肪變性評(píng)分和炎癥評(píng)分明顯降低(P<0.05)。計(jì)算NAS評(píng)分，正常對(duì)照組最低，糖尿病組最高，筋脈通組介于兩者之間。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組NAS評(píng)分升高(P<0.05)；筋脈通組與糖尿病組相比，NAS評(píng)分明顯降低且差異顯著(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 灌胃12周后各組大鼠脂肪變性評(píng)分、 炎癥評(píng)分NAS評(píng)分結(jié)果分)

注： 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與糖尿病組比較，bP<0.05。

2.5 Masson染色結(jié)果

Masson染色可將膠原纖維染成藍(lán)色，提示組織纖維化程度，細(xì)胞漿、肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃12周后各組大鼠肝臟組織均未見(jiàn)明顯的肝竇周染藍(lán)色。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：A、B：正常對(duì)照組；C、D：糖尿病組；E、F：筋脈通組(A、C、E×200；B、D、F×400)。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

注：A：正常對(duì)照組；B： 糖尿病組；C： 筋脈通組。

圖2 各組大鼠肝臟組織Masson染色結(jié)果(×400)

3 討論

隨著肥胖和代謝綜合征的流行，NAFLD已成為中國(guó)第一大慢性肝病和健康體檢肝功能異常的首要原因[10]。臨床以生活方式干預(yù)和針對(duì)代謝綜合征各組分的藥物治療為主，但無(wú)臨床證據(jù)顯示這些藥物可改善NASH和肝纖維化，間隔肝纖維化和肝硬化是NAFLD患者肝病不良結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，而NASH更易進(jìn)展為肝纖維化[11-12]，目前NAFLD缺乏有效治療方法，亟待深入研究。T1DM是一種多因素免疫介導(dǎo)的疾病，由遺傳易感性和環(huán)境危險(xiǎn)因素相互作用導(dǎo)致，發(fā)病年齡輕，血糖較難控制，并發(fā)癥出現(xiàn)早，其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。近年來(lái)有學(xué)者提出“雙重糖尿病”假說(shuō)，認(rèn)為部分患者同時(shí)具有T1DM(胰島β細(xì)胞被破壞)和T2DM(胰島素抵抗)的病因[3]，患有雙重糖尿病的個(gè)體同時(shí)存在代謝失調(diào)和自身免疫異常，其遺傳學(xué)特征與T1DM患者極為相似。因此，如果這類(lèi)患者合并NAFLD，治療難度更大，且進(jìn)一步增加心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[4]。

中藥復(fù)方筋脈通主要由菟絲子、女貞子、延胡索、水蛭、細(xì)辛、桂枝等藥物組成。方中菟絲子配女貞子補(bǔ)益腎之氣陰；延胡索行氣活血止痛，水蛭為血肉有情之品，配伍延胡索加強(qiáng)活血逐瘀之功；桂枝、細(xì)辛振奮氣血、溫通血脈。全方共奏補(bǔ)腎活血、溫通經(jīng)脈之功效，臨床用于治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變療效確切[13]。既往研究證實(shí)，筋脈通能夠改善T2DM患者及STZ誘導(dǎo)T1DM大鼠糖脂代謝[13-14]，并通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎以及抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制而起到神經(jīng)保護(hù)作用[9,15-16]，而糖脂代謝紊亂、炎癥及氧化應(yīng)激等在NAFLD發(fā)病中的作用已得到公認(rèn)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子中主要活性成分槲皮素[17]，女貞子中提取出的齊墩果酸和熊果酸[18]能夠改善NASH肝臟炎癥和脂肪變性；天然水蛭素有抗肝纖維化的作用[19]。因此，推測(cè)筋脈通對(duì)于T1DM大鼠肝臟具有保護(hù)作用。

本研究采用單次大劑量腹腔注射STZ成功復(fù)制T1DM動(dòng)物模型[9]。T1DM時(shí)胰島素絕對(duì)缺乏，肝臟葡萄糖輸出增加，外周組織葡萄糖攝取減少，同時(shí)糖酵解生成ATP供能途徑受阻，此時(shí)機(jī)體主要依靠動(dòng)員脂肪和蛋白質(zhì)分解來(lái)提供能量，最終導(dǎo)致血液葡萄糖和FFA水平顯著增高。過(guò)多的游離脂肪酸由肝細(xì)胞攝取并氧化成脂肪乙酰輔酶A。當(dāng)肝內(nèi)乙酰輔酶A過(guò)多而超過(guò)其氧化利用時(shí)，部分轉(zhuǎn)化為T(mén)G。當(dāng)TG合成超過(guò)其排泄時(shí)則貯積于肝細(xì)胞內(nèi)形成脂肪肝。本研究結(jié)果顯示，造模成功12周時(shí)糖尿病組肝/體重的比值增加，血清TG、FFA水平明顯升高，HE染色可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，以小泡性脂肪變?yōu)橹?，未?jiàn)明顯氣球樣變，與T2DM誘發(fā)的大、小脂滴并存的混合性脂肪肝，伴明顯氣球樣變不同[20]。而筋脈通干預(yù)可顯著下調(diào)肝/體重的比值，減輕血清脂代謝紊亂，改善肝臟脂肪變性。

NASH更易進(jìn)展為肝纖維化，最終發(fā)展為肝硬化和肝癌。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高，提示存在肝細(xì)胞損傷；肝組織HE染色可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)壞死灶，提示存在肝小葉炎癥。而筋脈通治療可明顯減輕血清和肝組織的炎癥狀態(tài)、壞死等，從而起到改善NASH的作用。根據(jù)肝臟脂肪變性、炎癥以及氣球樣變程度計(jì)算NAS評(píng)分可見(jiàn)糖尿病組最高，正常對(duì)照組最低，筋脈通組介于兩者之間，表明筋脈通可明顯減輕肝臟脂肪變性和小葉內(nèi)炎癥。肝組織Masson染色結(jié)果顯示，T1DM大鼠造模成功12周未見(jiàn)明顯竇周纖維化，可能與病程較短有關(guān)。

總之，本研究表明T1DM合并NAFLD肝組織學(xué)改變以小泡性脂肪變性為主，部分伴灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死，不伴明顯氣球樣變及纖維化。筋脈通能夠改善血清肝功能異常及脂代謝紊亂，減輕肝細(xì)胞脂肪變性、炎性浸潤(rùn)和壞死，從而起到肝臟保護(hù)作用。進(jìn)一步深入探索作用機(jī)制是今后研究的方向。