袁旭 邵帥 王剛

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，西安710032

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，其重要病理特征之一是表皮處中性粒細(xì)胞聚集形成微膿瘍［1］。隨著研究的深入，中性粒細(xì)胞的功能越來越受到人們關(guān)注。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET）由中性粒細(xì)胞釋放，骨架結(jié)構(gòu)為直徑15 ～17 nm的染色質(zhì)纖維［2］，主要由DNA 和瓜氨酸化的組蛋白（citrullinated histone 3，Cit-H3）構(gòu)成，其上附有中性粒細(xì)胞顆粒中的各種蛋白酶、抗菌肽等［3］。NET的形成過程是一種區(qū)別于凋亡及壞死等新的細(xì)胞死亡方式［4］。病原微生物組成成分如脂多糖等與人體中的免疫復(fù)合物及細(xì)胞因子能激活中性粒細(xì)胞內(nèi)活性氧系統(tǒng)（reactive oxygen species，ROS），引發(fā)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和肽基精氨酸脫亞酶Ⅳ（peptidyl arginine deiminaseⅣ，PAD4）的核轉(zhuǎn)位，終致核酸的解聚和釋放，產(chǎn)生NET 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［5］。NET不僅在機(jī)體抵御病原微生物入侵中發(fā)揮重要作用，且能夠參與多種自身免疫性疾病發(fā)病和進(jìn)展［4，6］。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，NET相關(guān)分子能夠激活巨噬細(xì)胞的炎癥小體Nod樣受體蛋白3（NLRP3）或黑素瘤缺乏因子2（AIM2），導(dǎo)致白細(xì)胞介素（IL）1β 和IL-18 的產(chǎn)生及釋放，而IL-1β 和IL-18 又能促使NET 形成，形成正反饋環(huán)路促進(jìn)炎癥進(jìn)展［7-8］。AIM2 炎癥小體是雙鏈脫氧核糖核苷酸（doublestranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）的受體之一，能夠識(shí)別外來病原體或自身受損細(xì)胞所暴露的DNA，通過活化前體胱天蛋白酶1（caspase-1）介導(dǎo)下游炎癥因子如IL-1β的產(chǎn)生及釋放參與免疫防御或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。本文探討以自身DNA和組蛋白作為骨架結(jié)構(gòu)的NET對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞AIM2炎癥小體的活化作用及其對(duì)銀屑病免疫微環(huán)境紊亂的影響。

材料與方法

一、標(biāo)本收集

篩選2018 年1-12 月于第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院就診的進(jìn)展期尋常型銀屑病患者，無其他系統(tǒng)性疾病，收集4例患者皮損標(biāo)本4份，另外4例患者外周血標(biāo)本4 份。于本院燒傷與整形外科收集健康對(duì)照皮膚組織標(biāo)本4份，于泌尿外科收集15歲以下兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮標(biāo)本3 份。本研究通過第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：KY20163202-1），所有受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

紅細(xì)胞裂解液（美國Thermal Fisher 公司）、CD15 人中性粒細(xì)胞分選磁珠抗體（美國Miltenyi biotec 公司）、磁珠陽性分選磁柱（美國Miltenyi biotec公司）、佛波酯（PMA，美國Sigma公司）、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）、中性蛋白酶Ⅱ（dispaseⅡ，美國sigma公司）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ，美國Thermal Fisher 公司）、即用型正常山羊血清（壯志生物科技有限公司）、中效細(xì)胞裂解液（RIPA）、SDS-PAGE凝膠試劑盒。RPMI 1640、Keratinocyte-SFM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），DAPI、Hoechest 核染料（碧云天生物技術(shù)有限公司）。Western 印記試驗(yàn)一抗：AIM2 兔抗（美國Cell Signaling Technology 公司）、IL-1β鼠抗（美國Abcam公司）；二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG抗體（康為世紀(jì)生物科技有限公司）。免疫熒光試驗(yàn)一抗：AIM2 兔抗、MPO 兔抗、NE 兔抗、IL-1β 鼠抗、Cit-H3 鼠抗（英國Abcam 公司）；二抗：CY3/FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗（康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

三、方法

1.免疫熒光檢測Cit-H3、MPO、NE、AIM2 在銀屑病皮損及健康對(duì)照皮膚中的表達(dá)：取銀屑病患者皮損及健康對(duì)照皮膚標(biāo)本組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、高壓抗原修復(fù)、即用型正常山羊血清封閉后分別加入以下一抗組合：Cit-H3 抗體和MPO 抗體、Cit-H3抗體和NE抗體或AIM2抗體，于濕盒中4 ℃孵育過夜、洗滌，滴加相應(yīng)的山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗，室溫避光孵育1 ～2 h 后洗滌切片，滴加DAPI 或Hoechst 核染料對(duì)細(xì)胞核染色，洗滌切片，樹脂封片，避光保存至上機(jī)檢測。

2.分離銀屑病患者外周血中性粒細(xì)胞：收取銀屑病患者外周血4 份（16 ml/份），使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，于300×g 離心10 min，棄上清液，重復(fù)2 次；隨后用150 μl 磁珠分選液重懸細(xì)胞，加入50 μl CD15磁珠抗體混勻，于4 ℃避光孵育15 ～20 min，隨后加入5 ml 磁珠分選液洗滌懸液，于300×g 離心10 min，棄上清液，用500 μl 磁珠分選液重懸細(xì)胞，加入陽性分選的磁柱中，收集CD15陽性細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。

3.提取中性粒細(xì)胞NET：將獲得的中性粒細(xì)胞用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基沖懸，按2 × 106個(gè)/孔種于A、B 兩塊12 孔板中，均予50 nmol/L PMA 刺激，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。吹打并收取A 板中所有懸液，400×g 離心10 min，收集上清液于1.5 ml 離心管中，隨后18 000×g離心15 min，棄上清液，加入1 ml PBS輕柔洗滌沉淀，18 000×g再次離心15 min，沉淀即為NET［10］。B 板各孔在PMA 刺激4 h 后，另加入DNaseⅠ（2 U/ml）于37 ℃處理20 min降解NET結(jié)構(gòu)，其余步驟同A板。采用分光光度計(jì)定量dsDNA 濃度，A 板127 ng/μl，B 板0.06 ng/μl。

4.人原代角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)：取新鮮包皮組織（離體時(shí)間＜2 h），沖洗后于75%乙醇浸泡消毒45 s，取出包皮組織，用含雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基沖洗3 遍，減去皮下組織，并將包皮修剪為1.5 cm×1 cm大小的組織塊，浸泡于0.25%dispaseⅡ溶液，4 ℃消化過夜。過夜后使用眼科鑷分離真表皮，盡量剪碎表皮并用胰蛋白酶于37 ℃消化7 ～10 min，之后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基終止消化，吹打分離細(xì)胞后用無菌濾網(wǎng)過濾并收集濾液，于250 × g 離心5 min，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基洗滌1次，于250×g離心5 min，棄上清液得到原代角質(zhì)形成細(xì)胞，使用Keratinocyte-SFM 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并種于小瓶中，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

5.NET處理細(xì)胞：將原代角質(zhì)形成細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代，分為4組，各以3×105個(gè)/孔接種至6孔板中，細(xì)胞完全貼壁后換液，分別加入PBS（對(duì)照組）、NET 提取物（NET 組）、經(jīng)DNase I 處理的NET提取物（NET 降解組）、DNase I（降解劑對(duì)照組）刺激細(xì)胞48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.Western印記檢測NET處理后角質(zhì)形成細(xì)胞AIM2 炎癥小體及其下游分子的表達(dá)：在4 組細(xì)胞中加入適量含苯甲基磺酰氟（PMSF）的中效RIPA，冰上靜置20 min，刮取并轉(zhuǎn)移各組細(xì)胞裂解液于對(duì)應(yīng)的離心管中，于4 ℃以14 000×g離心15 min，棄沉淀，保留蛋白溶液（BCA 法定量）。以15 μg 上樣量電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加入相應(yīng)一抗，于4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育2 h，洗滌后使用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/微管蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.ELISA 檢測IL-1β 水平：收集對(duì)照組與NET組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測定各樣本在450 nm波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣本對(duì)應(yīng)的吸光度值計(jì)算IL-1β濃度。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用GraphPad Prism 7軟件，計(jì)量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、銀屑病患者皮損處NET 標(biāo)記物與AIM2 炎癥小體的表達(dá)情況

免疫熒光結(jié)果顯示，銀屑病皮損表皮處可見Cit-H3（綠色）和MPO（紅色）呈絲網(wǎng)狀共染，或Cit-H3（綠色）和NE（紅色）共染（圖1），健康對(duì)照皮膚組織中未檢測到Cit-H3、MPO和NE熒光信號(hào)。

圖1 銀屑病皮損表皮中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu)免疫熒光染色 1A：皮損表皮處可見瓜氨酸化的組蛋白（Cit-H3，綠色）和髓過氧化物酶（MPO，紅色）呈絲網(wǎng)狀共染，健康對(duì)照皮膚無此熒光信號(hào)；1B：皮損表皮處可見Cit-H3（綠色）和中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶（NE，紅色）共染，健康對(duì)照皮膚無此熒光信號(hào)

健康對(duì)照皮膚組織中AIM2炎癥小體未見明顯表達(dá)，而銀屑病患者表皮處AIM2 蛋白熒光信號(hào)明顯，且主要位于微膿瘍毗鄰表皮處。見圖2。

二、NET 處理角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)AIM2 炎癥小體表達(dá)的影響

Western印記結(jié)果顯示，不同處理組細(xì)胞AIM2蛋白及下游分子IL-1β前體及IL-1β的蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.80、5.82、15.64，P ＜0.001），且NET 組均高于對(duì)照組（t = 15.14、4.256、8.710，均P ＜0.05），NET 降解組、降解劑對(duì)照組與對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。見表1、圖3。

三、NET 處理對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IL-1β 表達(dá)的影響

NET組角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β分泌水平（13.15 ± 3.77）pg/ml 高于對(duì)照組（3.61 ±0.20）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.53，P =0.024）。

討 論

銀屑病的發(fā)生發(fā)展涉及固有免疫及適應(yīng)性免疫的共同激活，中性粒細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，疾病的早期即被趨化并聚集在銀屑病皮損表皮處，是銀屑病皮損的重要病理特征，但其在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進(jìn)一步探索。多項(xiàng)研究證實(shí)，NET可以通過激活免疫細(xì)胞等參與多種自身免疫性炎癥進(jìn)展［11-13］。我們和其他團(tuán)隊(duì)的前期研究曾發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損處存在NET，且可加重病情［14］；在動(dòng)物模型中，使用PAD4 抑制劑抑制NET 形成，或用DNase I 清除NET 結(jié)構(gòu)均可顯著減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣表現(xiàn)和炎癥反應(yīng)［15］。然而，NET參與銀屑病發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

圖2 銀屑病皮損表皮黑素瘤缺乏因子2炎癥小體免疫熒光染色 皮損表皮處炎癥小體熒光信號(hào)明顯，且主要位于微膿瘍毗鄰表皮處（白色箭頭），健康對(duì)照皮膚中基本無此信號(hào)

表1 NET處理對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞AIM2炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 NET處理對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞AIM2炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。NET：中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)；AIM2：黑素瘤缺乏因子2 炎癥小體；IL-1β：白細(xì)胞介素1β。與對(duì)照組相比，a P ＜0.05；b P ＞0.05

組別對(duì)照組NET組NET降解組降解劑對(duì)照組F值P值A(chǔ)IM2 1 1.42±0.03a 1.15±0.07b 0.90±0.05b 23.80＜0.001 IL-1β前體1 1.32±0.08a 0.93±0.03b 1.03±0.12b 5.82＜0.001 IL-1β 1 1.40±0.05a 1.07±0.05b 0.96±0.07b 15.64＜0.001

圖3 Western 印記檢測中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）處理角質(zhì)形成細(xì)胞后皮黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體及IL-1β前體、IL-1β 的表達(dá) NET 組的相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，NET 降解組、降解劑對(duì)照組與對(duì)照組間無明顯差異

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者表皮中浸潤的中性粒細(xì)胞中有NET結(jié)構(gòu)形成，且皮損微膿瘍毗鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞中可顯著表達(dá)AIM2炎癥小體。體外研究結(jié)果證實(shí)，NET刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，后者AIM2炎癥小體表達(dá)水平顯著升高，提示NET可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中AIM2 的表達(dá)。我們進(jìn)一步檢測了AIM2的經(jīng)典下游細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NET刺激組角質(zhì)形成細(xì)胞后可使IL-1β前體和成熟IL-1β的分泌水平明顯升高。在銀屑病中，IL-1β 是重要的致病促炎因子之一，它能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子如CCL20，趨化γδT 細(xì)胞亞群至皮損局部，同時(shí)還能激活γδT細(xì)胞促使其分泌IL-17A，加劇炎癥進(jìn)程［16］。而采用DNase I 降解NET 結(jié)構(gòu)后，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞AIM2 和IL-1β 的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)的影響。以上結(jié)果提示，本研究中從銀屑病患者外周血中提取的NET 能激活角質(zhì)形成細(xì)胞中炎癥小體通路，促進(jìn)IL-1β的成熟及釋放，最終參與銀屑病免疫微環(huán)境的紊亂。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正常人外周血中性粒細(xì)胞提取的NET 有相似的致病效應(yīng)，這可能是因?yàn)闊o論中性粒細(xì)胞來源如何，體外誘導(dǎo)的NET本身即為病理結(jié)構(gòu)，故而能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞。

綜上所述，本研究采用免疫熒光檢測到銀屑病患者皮損存在顯著高于健康對(duì)照皮膚的NET、AIM2。體外研究提示，NET 可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥小體通路，加重銀屑病皮損局部的免疫紊亂。二者聯(lián)系的建立，為固有免疫細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用提供了新的探究思路，也為靶向NETAIM2及下游炎癥因子的特異性治療提供了初步理論支持。但NET 通過何種機(jī)制活化角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥小體及其下游炎癥因子，還需進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突