康彬彬,劉龍燕,王 祥,丁力杰,林河通,陳團(tuán)偉,*

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建福州 350007;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

花色苷(anthocyanin)是花青素與糖基通過糖苷鍵結(jié)合而成的具有2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)的多酚類化合物,廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi),具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌等多種生理功能[1-4],已成為功能性食品、化妝品以及藥品等開發(fā)利用中的一類重要功能因子。烏飯果為越橘屬(Vaccinium)野生植物烏飯樹(VacciniumbracteatumThunb.)的紫黑色球狀漿果,10～11月成熟,富含氨基酸、礦物質(zhì)、花色苷、黃酮等營養(yǎng)功能成分[5],在民間,特別是我國畬族地區(qū)對烏飯果的利用較早,除直接食用外,主要利用烏飯果和烏飯葉的汁液對大米進(jìn)行染色和烹調(diào)制作“烏米飯”[6],而對烏飯果花色苷功能成分的提取和生理活性研究較為缺乏。

當(dāng)前,溶劑法以其簡單、易操作、成本低等特點被廣泛應(yīng)用于花色苷的提取,但由于花色苷存在于纖維素、果膠構(gòu)成的細(xì)胞壁內(nèi),導(dǎo)致提取時間長、花色苷得率低[7]。為了提高花色苷的得率,國內(nèi)外學(xué)者多采用超聲波[8]、微波[9]、超高壓[10]、酶[11]等輔助提取花色苷,能有效縮短提取時間,提高提取效率,其中,酶法輔助提取以其高效、環(huán)保、高得率等優(yōu)點已成為植物花色苷提取的有效手段,李穎暢等[11-15]先后開展了纖維素酶或果膠酶提取藍(lán)莓果、紫薯、紫山藥、紫皮豇豆、黑米中花色苷的工藝研究,結(jié)果表明酶輔助提取能顯著提高花色苷得率,但有關(guān)復(fù)合酶法提取烏飯果花色苷方面的研究目前暫未見報道。因此,本文以乙醇為提取溶劑,通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化烏飯果花色苷的復(fù)合酶法提取工藝,并分析評價烏飯果花色苷的體外抗氧化活性,旨在為烏飯果花色苷活性成分的高效提取及其進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生烏飯果 采自福建省福鼎市貫嶺鄉(xiāng),采收當(dāng)天運(yùn)至福州實驗室,經(jīng)清洗、真空干燥(60 ℃、0.1 Mpa)至含水率<10%后粉碎過40目篩,粉體置于棕色瓶中密封備用;纖維素酶 15000 U·g-1,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;果膠酶 1000 U·g-1,瑞士Fluka公司;大豆卵磷脂(98%) 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司;抗壞血酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;過氧化氫、乙醇、鹽酸、鄰苯三酚等 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司;D2F-6050型真空干燥設(shè)備、PB-10 pH計、DK-S26型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗設(shè)備有限公司;BS-124S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;UV-2000紫外可見分光光度儀 尤尼柯(上海)儀器有限公司;SK-1快速混勻器 常州國華電器有限公司;H2050R冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司;FDU-1200 冷凍干燥機(jī) 日本東京 EYELA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 準(zhǔn)確稱取烏飯果粉末1.000 g加入錐形瓶中,以50%乙醇為提取溶劑,選取加酶量、復(fù)配比、酶解溫度、酶解時間、初始pH、料液比等進(jìn)行復(fù)合酶法提取單因素實驗,酶解液經(jīng)90 ℃滅酶10 min,1000 r/min離心10 min,收集上清液,定容至15 mL,535 nm下紫外-可見分光光度測定其吸光值,考察不同提取條件對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.1 加酶量對烏飯果花色苷含量的影響 在酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5,纖維素酶:果膠酶1∶1下,研究加酶量(30、50、100、150、200、250、300 U·g-1原料)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.2 酶配比對烏飯果花色苷含量的影響 在酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5,加酶量100 U·g-1原料下,研究纖維素酶:果膠酶酶配比(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.3 酶解溫度對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5下,研究酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.4 酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5下,研究酶解時間(60、90、120、150、180、210、240、270 min)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.5 酶解pH對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1下,加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH,研究不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.6 料液比對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,初始pH4.5下,研究不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40 g·mL-1)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,選取纖維素酶∶果膠酶配比2∶1,pH4.0,料液比1∶30 g·mL-1條件下,以加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)為響應(yīng)變量,花色苷含量(mg·100 g-1)為響應(yīng)值,通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化烏飯果花色苷的復(fù)合酶法提取工藝條件。因素編碼及各響應(yīng)變量水平見表1。

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of quadricregression orthogonal rotary tests

1.2.3 花色苷含量的測定 基于花色苷在波長535 nm處有最大吸收峰[15-17],參照Wu等[17]的Fuleki法測定烏飯果花色苷提取液在535 nm處的吸光值A(chǔ)535,并按照式(1)計算烏飯果花色苷含量。

式(1)

式中,C-烏飯果花色苷含量,mg·100 g-1;A535-535 nm處吸光值;V-定容后體積,mL;N-稀釋倍數(shù);98.2-1%花色苷在535 nm處的平均消光系數(shù);m-烏飯果粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 烏飯果花色苷體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 烏飯果花色苷的制備 將上述最佳工藝條件下制備的烏飯果花色苷酶解液,經(jīng)1000 r/min離心15 min,收集上清液于40 ℃下減壓蒸發(fā)去除乙醇后冷凍干燥,制得凍干粉。準(zhǔn)確稱取一定量烏飯果花色苷凍干粉,用1.5 mol/L鹽酸-95%乙醇(v/v,15/85)配制成不同質(zhì)量濃度的烏飯果花色苷樣品溶液。

1.2.4.2 羥自由基(·OH)清除能力的測定 參考李穎暢等[18]的水楊酸-Fe2+氧化法測定花色苷提取液在510 nm處的吸光值,并按照式(2)計算·OH清除率。同時以同質(zhì)量濃度抗壞血酸(10、20、40、60、80、100、120、140、160 μg·mL-1)為陽性對照。

·OH清除率/%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式(2)

式中,A0-1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液的吸光值;A1-1.0 mL樣品溶液的吸光值;A2-1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液的吸光值。

式(3)

式中,A0-蒸餾水代替樣品溶液的吸光值;A1-樣品溶液的吸光值。

1.2.4.4 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定 根據(jù)李穎暢等[18]的方法,并略作修改。分別于試管中依次加入1.0 mL大豆卵磷脂溶液,1.0 mL 0.4 mmol/L FeSO4和1.0 mL不同濃度的樣品溶液(100、200、400、600、800、1000 μg·mL-1),混勻,于37 ℃水浴下避光保存60 min,再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl混合液,90～100 ℃水浴15 min后迅速冷卻,3000 r/min離心10 min,取上清液在535 nm處測定吸光值A(chǔ)s?？瞻坠芤哉麴s水代替樣品,測定其吸光值A(chǔ)c。參比管以1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL卵磷脂,并按照式(4)計算脂質(zhì)過氧化抑制率。同時以同質(zhì)量濃度抗壞血酸為陽性對照。

脂質(zhì)過氧化抑制率(%)=(Ac-As)/Ac×100

式(4)

式中,Ac-空白液的吸光值;As-樣品溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上指標(biāo)均重復(fù)取樣測定3次,采用DPS V12.01軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。采用Excel 2007和Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加酶量對烏飯果花色苷含量的影響 從圖1A可以看出,烏飯果花色苷含量隨加酶量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(P<0.05),這可能是由于加酶量較低時酶解破壁不完全,細(xì)胞內(nèi)花色苷未能完全釋放,導(dǎo)致花色苷含量較低,而加酶量過大,酶可能發(fā)生相互附著,從而降低酶與底物的傳質(zhì)效率,影響酶解速率,導(dǎo)致花色苷含量下降[13]。因此,確定復(fù)合酶的最佳加酶量為100 U·g-1。

2.1.2 不同配比對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1B可知,纖維素酶∶果膠酶為2∶1時,烏飯果花色苷的提取量達(dá)到最大,含量為126.56 mg·100 g-1,而在纖維素酶或果膠酶含量過大時,花色苷含量有所下降。因此,確定纖維素酶和果膠酶的配比為2∶1。

2.1.3 酶解溫度對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1C可知,酶解溫度對烏飯果花色苷含量影響顯著(P<0.05),隨著酶解溫度的升高,由于底物分子適度展開且動能增加,加快了酶解反應(yīng)速度,花色苷含量增加,但當(dāng)溫度超過50 ℃后,酶可能因為部分失活變性導(dǎo)致酶解反應(yīng)受到抑制,花色苷含量反而下降[11]。因此,選取40 ℃為較佳酶解溫度,此時花色苷含量為127.08 mg·100 g-1。

2.1.4 酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響 在60～120 min酶解時間內(nèi),隨著酶解時間的延長,酶解反應(yīng)較充分(P<0.05),有利于細(xì)胞內(nèi)花色苷的溶出,但酶解時間過長可能引起酶活力降低,同時花色苷由于長時間酶解發(fā)生部分降解,導(dǎo)致花色苷含量下降(圖1D)。因此,確定該復(fù)合酶體系的最適酶解時間為120 min。

2.1.5 pH對烏飯果花色苷含量的影響 酶活力高低及花色苷穩(wěn)定性與酶解體系的pH密切相關(guān),由圖1E可以看出,烏飯果花色苷含量隨pH上升呈先上升后下降的趨勢(P<0.05),這可能與纖維素酶和果膠酶活性發(fā)揮的最適pH有關(guān)[20],且相關(guān)研究表明花色苷在酸性條件下較為穩(wěn)定[14]。因此,選擇pH4.0作為本試驗復(fù)合酶解的最適pH,此pH下烏飯果花色苷含量最高,達(dá)130.33 mg·100 g-1。

2.1.6 料液比對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1F可以看出,烏飯果花色苷含量隨料液比的增大而增加(P<0.05),而后趨于平穩(wěn)。當(dāng)料液比為1∶30 g·mL-1時,花色苷含量為133.76 mg·100 g-1,而繼續(xù)增加到1∶40 g·mL-1時,花色苷含量僅提高1.14%與1∶30 g·mL-1時相比,差異不顯著(P>0.05)。這可能是因為在一定的加酶量下,提取溶劑的增加有利于烏飯果細(xì)胞內(nèi)花色苷的擴(kuò)散和釋放[12]。因此,從效率和經(jīng)濟(jì)因素考慮,料液比以1∶30 g·mL-1為宜。

圖1 各單因素對烏飯果花色苷含量的影響Fig.1 Effects of different extraction parameters on the contents of anthocyanin from Vaccinium bracteatum Thunb. fruits注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 烏飯果花色苷復(fù)合酶法提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以花色苷含量為指標(biāo),采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對烏飯果花色苷復(fù)合酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,試驗結(jié)果見表2。

為了更明確各因素加酶量X1、酶解溫度X2和酶解時間X3對花色苷含量的影響,采用DPS V12.01數(shù)據(jù)處理軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析和擬合,得到如下回歸數(shù)學(xué)模型:

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗及結(jié)果Table 2 Results of quadric regression orthogonal rotary tests

方差分析結(jié)果表明(表3),加酶量、酶解溫度和酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響達(dá)極顯著水平(P<0.01),各因素的主次順序為:加酶量>酶解時間>酶解溫度。此外,加酶量、酶解溫度和酶解時間等因素的二次項對花色苷含量的影響也達(dá)極顯著(P<0.01)。

表3 方差分析 Table 3 Variance analysis

2.2.2 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化 加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)對花色苷含量(Y)的響應(yīng)面分析結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知,響應(yīng)曲面較為陡峭,表明花色苷含量對酶解溫度和加酶量的改變較為敏感。當(dāng)加酶量一定時,花色苷含量隨酶解溫度的增加,先增大后快速下降,保持酶解溫度一定時,花色苷含量隨加酶量增加也呈先增大后減小,且酶解溫度較加酶量對花色苷含量的影響顯著,等高線成橢圓形,表明酶解溫度與加酶量具有較強(qiáng)的交互作用;從圖2B可以看出,響應(yīng)曲面較為平緩,表明花色苷含量受酶解時間和加酶量的交互作用。當(dāng)加酶量一定時,花色苷含量隨酶解時間的延長,先增大后下降,保持酶解時間一定時,花色苷含量隨加酶量的增大也呈先增大后減小的趨勢,等高線呈扁圓形,表明酶解時間和加酶量具有一定的交互作用,但不顯著;由圖2C可知,響應(yīng)曲面陡峭,表明花色苷含量對酶解溫度和酶解時間的改變較為敏感。當(dāng)酶解溫度一定時,花色苷含量隨酶解時間的延長,先增大后下降,保持酶解時間一定時,花色苷含量隨酶解溫度增大呈先增大后減小,說明酶解溫度過高和酶解時間過長均不利于花色苷的提取,等高線呈橢圓形,表明酶解時間和酶解溫度具有較強(qiáng)的交互作用。因此,綜合表3及圖2,通過DPS12.01數(shù)據(jù)處理軟件分析,確定出烏飯果花色苷的復(fù)合酶法提取最佳工藝條件為:加酶量234 U·g-1,纖維素酶∶果膠酶2∶1,pH4.0,料液比1∶30 g·mL-1,酶解溫度50 ℃,酶解時間180 min,該條件下烏飯果花色苷含量為137.61 mg·100 g-1。進(jìn)一步的驗證試驗得花色苷含量(136.08±4.49) mg·100 g-1,與預(yù)測值接近(RSD為1.12%),這一結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化烏飯果花色苷的復(fù)合酶法提取工藝是可靠的。

圖2 雙因素效應(yīng)分析圖Fig.2 Analysis of double factor effect

2.3 烏飯果花色苷的體外抗氧化活性

2.3.1 烏飯果花色苷對·OH的清除能力 羥自由基(·OH)是引起生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生命大分子物質(zhì)發(fā)生氧化和損傷的一類重要活性氧自由基[21]。由圖3可知,烏飯果花色苷具有較強(qiáng)的·OH清除能力,且隨質(zhì)量濃度增加而增大,但清除率顯著低于抗壞血酸組(P<0.01)。通過計算半抑制濃度IC50(清除率或抑制率達(dá)到50%時所需樣品的質(zhì)量濃度)發(fā)現(xiàn),烏飯果花色苷與抗壞血酸的IC50分別為92.23和73.98 μg·mL-1,表明烏飯果花色苷清除·OH的能力弱于抗壞血酸。

圖3 烏飯果花色苷與抗壞血酸對·OH清除能力的比較Fig.3 Comparision of scavenging effect ofhydroxyl radicals between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid注:*和**分別表示同濃度下烏飯果花色苷與抗壞血酸抗氧化活性差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01);圖4～圖5同。

圖4 烏飯果花色苷與抗壞血酸對清除能力的比較Fig.4 Comparision of scavenging effectsuperoxidefree radicals between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid

2.3.3 烏飯果花色苷對脂質(zhì)過氧化的抑制能力 細(xì)胞膜磷脂是活性自由基進(jìn)攻的主要靶物質(zhì),其被氧化造成細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞,從而引起細(xì)胞損傷和壞死,危害人機(jī)體組織[18]。烏飯果花色苷對大豆卵磷脂過氧化抑制能力的影響如圖5所示。由圖可見,烏飯果花色苷對由Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體具有明顯的抑制作用,其抑制率隨樣品濃度的增加而增大,當(dāng)濃度為400 μg·mL-1時,其對脂質(zhì)體過氧化的抑制率為61.15%,而抗壞血酸為52.83%。烏飯果花色苷抑制脂質(zhì)體過氧化的IC50為303.1 μg·mL-1,抗壞血酸為366.2 μg·mL-1,說明烏飯果花色苷對脂質(zhì)體過氧化的抑制能力強(qiáng)于抗壞血酸(P<0.05)。

圖5 烏飯果花色苷與抗壞血酸對脂質(zhì)體過氧化抑制能力的比較Fig.5 Comparision of inhibition effect of lipidper-oxidation between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid

3 結(jié)論