史瑩瑩,邵俊鋒,郭 娟,許慧卿

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

羊肉鮮嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,中醫(yī)上具有助元陽(yáng)、補(bǔ)精血、療肺虛、益勞損的功效,是進(jìn)補(bǔ)的佳品。我國(guó)是羊肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),群眾對(duì)羊肉及肉制品的需求量日益增加[1]。歐洲的“馬肉風(fēng)波”對(duì)肉制品市場(chǎng)影響巨大,國(guó)內(nèi)掛羊頭賣狗肉的假羊肉事件屢見不鮮。用低廉的肉進(jìn)行摻假,這涉及經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)、食品安全甚至宗教信仰等問題。

目前對(duì)肉類種屬鑒別的方法主要有:以特征形態(tài)為基礎(chǔ)的感官鑒別、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)鑒別方法以及以核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等[2-3]。感官鑒別屬于粗略鑒別法,且檢測(cè)結(jié)果容易受實(shí)驗(yàn)人員的主觀因素影響[4]。由于加工處理過程中蛋白質(zhì)的質(zhì)量受肉制品的新鮮度、加工程度等因素的影響,蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定,存在干擾結(jié)果且重復(fù)性差[5-6]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是利用特異性引物體外擴(kuò)增目的DNA片段,然后對(duì)所得DNA片段進(jìn)行分析從而達(dá)到鑒別物種的目的。常見的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR、DNA測(cè)序等[7-8]。自從1998年Tartaglia等[9]首次報(bào)道基于普通PCR方法檢測(cè)飼料中的牛、羊源性成分,PCR鑒定物種的方法日趨成熟。何瑋玲等[10]利用Cytb基因的差異性位點(diǎn),設(shè)計(jì)了相同上游引物但下游各自特異性的4條PCR引物,建立了一種快速定性鑒別豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分的多重PCR方法。微滴數(shù)字PCR精確度高但實(shí)驗(yàn)成本昂貴以及實(shí)驗(yàn)條件要求高且操作復(fù)雜[11]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入染料或者探針等熒光基團(tuán),通過熒光信號(hào)強(qiáng)度變化實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)中DNA濃度的變化,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類產(chǎn)品進(jìn)行鑒定[12]。范麗麗等[13]選擇Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),專門針對(duì)牛細(xì)胞色素b設(shè)計(jì)引物和探針,以Ct值在28以內(nèi)確定牛源性成分的存在。Farrokhi等[14]運(yùn)用SYBR Green1實(shí)時(shí)熒光方法對(duì)清真認(rèn)證豬源性成分檢測(cè),通過Tm值顯示擴(kuò)增特異性,其豬肉最低檢出限達(dá)0.1 ng/μn。但目前利用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)肉制品摻假成分進(jìn)行定性定量的檢測(cè)還鮮有報(bào)道。因此,在對(duì)羊肉種屬定性鑒定的基礎(chǔ)上,擬建立一種對(duì)冷鮮羊肉制品中羊肉成分含量的定量檢測(cè)方法?？紤]到檢測(cè)的精準(zhǔn)度、操作的難易以及實(shí)驗(yàn)成本的合理性,選擇實(shí)時(shí)熒光定量方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肉及肉制品 揚(yáng)州市大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)超市;血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ Takara公司;TE緩沖液、引物 生工生物工程(上海)股份有限公司。

StepOne Real-time PCR儀 Applied Biosystems,USA;Nanodrop2000核酸蛋白定量?jī)xThermo Scientific,USA;DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠;Tanon3500凝膠成像一體機(jī) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 分別取1 g生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肉充分剪碎,置于預(yù)冷潔凈的研缽中,用液氮研磨至粉末狀,在粉末未解凍前快速轉(zhuǎn)入5 mL潔凈離心管,-70 ℃保存。

1.2.2 混合樣品的制備 精確稱取生鮮豬、羊肉(精確度0.0001 g),按質(zhì)量比混合,得到羊肉質(zhì)量百分比為10%、30%、50%、70%、90%和5%、15%、45%、65%、95%總質(zhì)量為1 g的豬羊肉混合肉樣。液氮研缽處理保存方法同1.2.1。

1.2.3 DNA提取 采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取的樣品總DNA。取50 mg上述樣品于1.5 mL潔凈離心管,按提取說明書稍做改進(jìn),加入蛋白酶K消化時(shí)間延長(zhǎng)至6 h直至肌肉組織溶解,后按說明繼續(xù)操作。將提取的樣品DNA溶于80 μL TE洗脫液中,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DNA濃度和純度測(cè)定 取TE為空白調(diào)零,取2 μL樣品,用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取后的DNA模板的濃度、A260/A280及A260/A230比值。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)模板DNA提取效果。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR體系

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)美國(guó)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的羊線粒體細(xì)胞色素b基因序列(登錄號(hào)MH938654.1),運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)篩選對(duì)羊有特異性的PCR擴(kuò)增引物RTY。采用相對(duì)定量法,選擇在結(jié)構(gòu)和功能上具高度保守性的16S rDNA作為內(nèi)參管家基因[15],并且設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)源基因引物16S。16S上游引物:5′-ACCGTGCAAAGGTAGCAT AATCA-3′,下游引物:5′-GCTCCATAGGGTCTTC TCGTCTT-3′,產(chǎn)物大小82 bp。RTY上游引物:5′-GGGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-3′,下游引物5′-GATTTTTCGCCTTTCACTTTATT-3′,產(chǎn)物大小243 bp。引物交于上海生工合成,用無菌無酶水溶解,配制成100 μmol/L的儲(chǔ)備液。

1.2.5.2 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系10 μL:TBGreen Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus)(2×)5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,DNA模板1.0 μL,滅菌水3.0 μL。兩步法PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火 30 s,共40個(gè)循環(huán)。對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析,無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

1.2.6 引物特異性研究 以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種畜禽肉DNA為模板,濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL,各取1 μL,用RTY引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),分析RTY引物擴(kuò)增的物種特異性。

1.2.7 內(nèi)參引物通用性 研究以市售新鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種畜禽肉DNA為模板,濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL,各取1 μL,用16S內(nèi)參引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),分析內(nèi)參引物對(duì)常見物種擴(kuò)增的通用性。

1.2.8 引物靈敏度檢測(cè) 將提取的羊肉DNA原液稀釋至50 ng/μL,然后進(jìn)行5倍系列梯度稀釋,即50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2、0.64 pg/μL等梯度,去離子水作為陰性對(duì)照模版,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

1.2.10 模擬混合肉樣檢測(cè) 以總質(zhì)量50 mg且已知質(zhì)量比為5%、15%、45%、65%、95%豬羊混合肉樣,分別提取DNA,濃度統(tǒng)一至50 ng/μL。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。以16SrDNA作為內(nèi)參,將ΔCt值帶入1.2.9所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算羊源性成分質(zhì)量百分比。和實(shí)際質(zhì)量百分比做商,計(jì)算其回收率,以檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

1.2.11 市售羊肉制品檢測(cè) 在大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或者超市采購(gòu)羊肉制品包括羊肉串、肥羊卷、熟食羊肉等。將樣品置于滅菌水浸泡漂洗后提取DNA,按1.2.5所述實(shí)驗(yàn)條件、體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。檢測(cè)是否含有羊源性成分,并通過ΔCt值計(jì)算樣品中羊肉含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果

不同肉類DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果見表1。核酸提取過程中容易混入蛋白質(zhì)及碳水化合物等雜質(zhì)。A260/A280>1.8可以說明溶液中無蛋白質(zhì)污染,A260/A230比值可以幫助判斷核酸溶液中是否混有糖類等雜質(zhì),當(dāng)A260/A230<2.0時(shí),則說明DNA溶液被碳水化合物污染[16]。由表1可知,取的生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肌肉組織DNA A260/A280、A260/A230比值符合上述要求,未被污染。提取的生鮮豬、牛、羊、雞、鴨肌肉組織DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示,條帶清晰無拖尾且完整。說明提取的DNA可用于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

表1 DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果Table 1 DNA concentration and purity test results

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 2% agarose gel electrophoresis注:泳道1:生鮮豬;泳道2:生鮮牛;泳道3:生鮮羊;泳道4:生鮮雞;泳道5:生鮮鴨。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物特異性、內(nèi)參引物通用性檢測(cè)結(jié)果

用引物RTY對(duì)不同肉的DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果如圖2所示。羊DNA模板的16個(gè)循環(huán)之后即進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期,而豬、牛、雞、鴨模板則在28個(gè)循環(huán)之后,無酶水則>30。羊肉模板和其他肉類Ct值差異明顯,以去無酶水作為陰性對(duì)照,引物RTY對(duì)非目標(biāo)物種熒光擴(kuò)增效率差[17]。即設(shè)計(jì)的引物RTY對(duì)羊源性成分特異性較高。

圖2 引物RTY對(duì)不同肉類DNA的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using RTY primer

用內(nèi)參引物16S引物對(duì)不同肉的DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果如圖3所示。16S對(duì)常見的5種畜禽肉有較好的擴(kuò)增效率,Ct值相對(duì)穩(wěn)定,集中在狹窄范圍內(nèi)。結(jié)果表明,內(nèi)參引物16S具有通用性,可以作為內(nèi)參校正基因使用[18]。RTY引物和內(nèi)參基因16S的熔解曲線Tm值分別為82.86 ℃(圖4)和77.97 ℃(圖5),均為特異的單個(gè)峰。熔解曲線則結(jié)果表明沒有引物二聚體和其它非特異性峰的存在,目標(biāo)片段具有高度特異性。

圖3 引物16S對(duì)不同肉類DNA的擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curves of DNA samples derivedfrom different meats using 16S primer

圖4 引物RTY擴(kuò)增熔解曲線Fig.4 Melting curves of prime RTY

圖5 內(nèi)參引物16S擴(kuò)增熔解曲線Fig.5 Melting curves of internal reference primer 16S

2.3 引物RTY靈敏度檢測(cè)

為檢測(cè)引物RTY的靈敏度,將提取的羊肉DNA原液稀釋至50 ng/μL,5倍系列梯度稀釋,以去離子無酶水作為陰性對(duì)照。對(duì)濃度50 ng/μL～0.64 pg/μL的模板DNA進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。當(dāng)模板濃度低至16 pg/μL時(shí),仍清晰地進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。濃度再低時(shí)擴(kuò)增曲線差別小,且和陰性對(duì)照結(jié)果接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法檢測(cè)限可達(dá)16 pg/μL。

圖6 引物RTY對(duì)不同DNA濃度梯度的擴(kuò)增曲線Fig.6 Amplification curve for different DNAconcentration gradients of primer RTY

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

不同羊肉含量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光反應(yīng),其對(duì)應(yīng)的Ct值結(jié)果表2所示。以標(biāo)準(zhǔn)品中羊肉含量百分對(duì)數(shù)值lg(羊肉質(zhì)量含量百分比%)為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值差值ΔCt(ΔCt=Ct羊肉-Ct內(nèi)參)為縱坐標(biāo),得到肉質(zhì)量百分比的對(duì)數(shù)值與ΔCt的線性關(guān)系,繪制羊肉質(zhì)量百分比的對(duì)數(shù)值與ΔCt值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。經(jīng)Excel模擬出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式為y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,PCR的反應(yīng)效率E(%)=(10-1/k-1)×100(k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率),標(biāo)準(zhǔn)曲線E=96.62%?！秾?shí)時(shí)熒光定量國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)-MIQE指南》規(guī)定:R2>0.980以及90%<擴(kuò)增效率E<105%。結(jié)果表明,本標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系和擴(kuò)增效率,符合實(shí)時(shí)熒光定量國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表2 不同羊肉含量百分比Ct以及ΔCt值檢測(cè)結(jié)果Table 2 Ct and ΔCt value of differentbeef content percentage standards

圖7 羊肉質(zhì)量百分比的對(duì)數(shù)值與ΔCt值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve between the log value ofmutton mass percentage and the corresponding ΔCt value

模擬含羊肉質(zhì)量為5%、15%、45%、65%、95%的豬羊混合肉樣品,按1.2.5反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。將所得實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)得的數(shù)據(jù)的ΔCt值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算羊肉質(zhì)量含量百分比,并且計(jì)算回收率,以檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量測(cè)定的可行性,結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明,檢測(cè)的羊肉質(zhì)量含量百分比與模擬的混合豬羊肉中羊肉質(zhì)量含量百分比實(shí)際值符合程度高?；厥章蕿?3.07%～106.20%,較為理想。本試驗(yàn)建立的量化肉制品中羊肉成分的實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量方法具有實(shí)踐意義。

表3 模擬混合肉樣Ct值檢測(cè)結(jié)果Table 3 Ct value of simulated mixed meat sample

2.6 市售羊肉制品檢測(cè)結(jié)果

選擇市售8份羊肉制品提取DNA,樣品均來自某市大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市。樣品包括羊肉串、羊肉卷、熟食羊肉等。利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系檢測(cè)其羊源性成分,每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行,市售羊肉制品的羊肉質(zhì)量百分比檢測(cè)結(jié)果如表4所示。其中有3份含量達(dá)98%以上,3份含量低于50%,2份含量在60%左右。從市售抽樣結(jié)果看,確實(shí)存在摻假羊肉制品欺騙消費(fèi)者的不法現(xiàn)象,相關(guān)部門需加強(qiáng)監(jiān)管以及打擊力度。

表4 市售羊肉制品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results for quantitative test the commercial meat mixtures

選擇實(shí)時(shí)熒光PCR方法,以羊線粒體細(xì)胞色素b為靶位基因,設(shè)計(jì)出對(duì)羊有特異性擴(kuò)增的引物。在檢測(cè)結(jié)果能是否檢出的羊源性成分定性判斷基礎(chǔ)上,選擇16S rDNA為內(nèi)參引物,外源性基因以及內(nèi)參基因聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)。羊肉質(zhì)量百分比的對(duì)數(shù)值與之對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值差值ΔCt呈良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式為y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,擴(kuò)增效率達(dá)E達(dá)96.62%。本試驗(yàn)中羊源性DNA檢測(cè)限可達(dá)16 pg/μL。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,證明該方法適用于對(duì)羊肉成分的鑒定以及含量的檢測(cè)。本方法不需要設(shè)計(jì)復(fù)雜又昂貴的熒光探針,封閉體系無需后續(xù)的電泳以及紫外拍照等操作,很大程度縮短了檢測(cè)時(shí)間,并且減少PCR產(chǎn)物污染避免假陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確?，F(xiàn)行有效的對(duì)牛羊源性成分的定性檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法僅適用于飼料中(GB/T 20190-2006)[19],還沒制定出牛羊肉制品相關(guān)的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法,本方法可為其研究提供參考意見。本文僅提出了針對(duì)生鮮冷凍肉制品的羊源性成分的鑒定以及含量測(cè)定的方法,對(duì)不同加工方法之后的肉制品鑒定方法還需進(jìn)一步探究。