寇宗亮,關(guān) 欣,藍(lán)麗紅,張金彥,李湘靜,黃思穎,藍(lán) 平

(廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西多糖材料及改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西高?；瘜W(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006)

淀粉是一種天然多糖,具有無毒性、相容性良好、非免疫原性和低抗原性等特點(diǎn)[1-3],作為一種無毒和生物可降解的聚合物材料已被廣泛地用于制備生物納米載體[4]。其有大量可被修飾的官能團(tuán),當(dāng)釋放功能性物質(zhì)后可降解為寡糖且易吸收,不會(huì)導(dǎo)致炎癥發(fā)生[5]。由于天然淀粉存在水溶性差、糊化液易老化[6]等缺點(diǎn),使其應(yīng)用受到限制。

為了拓寬木薯淀粉的應(yīng)用范圍,研究者們通過物理[7-8]、化學(xué)、生物[9]等改性方法對(duì)淀粉進(jìn)行功能化修飾,使其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥[10-11]、化工等各個(gè)領(lǐng)域。由于化學(xué)改性可以通過在淀粉分子的羥基上引入功能性基團(tuán)使其獲得其他功能特性,近年來受到人們的追捧[12]。通過淀粉分子上的羥基與其他基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng),可以制備各種功能性物質(zhì)載體[13-14]。然而在食品包裝部和各種抗性食品的應(yīng)用中,多為玉米淀粉[15],木薯淀粉的應(yīng)用較為鮮見。

膠束作為功能性載體的一種,近年來因體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性好,常被用作傳遞介質(zhì),受到的關(guān)注程度越來越高[16]。兩親性聚合物的親水片段和疏水片段在濃度較低時(shí),聚合物分子以單分子的形式存在;當(dāng)聚合物濃度達(dá)到某一數(shù)值后,聚合物分子能夠自組裝形成聚合物膠束[17-18]。

為了改善木薯淀粉諸多缺點(diǎn)限制,拓寬其在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,本研究利用木薯淀粉作為基材,首先以異丙基縮水甘油醚作為溫度敏感的疏水基團(tuán),接枝于淀粉分子骨架上將淀粉分子功能化。然后接枝生物相容性的聚乙二醇(mPEG)作為親水基團(tuán)。利用傅里葉紅外變換光譜(FTIR)、核磁共振(1H-NMR)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,驗(yàn)證木薯淀粉基聚合物是否成功合成。然后利用透射電鏡(TEM)、熒光分子探針和馬爾文激光納米粒度散射儀對(duì)其形貌和粒徑進(jìn)行表征。最后以姜黃素作為藥物模型,進(jìn)一步探究其在不同溫度環(huán)境中的釋放行為。為制備新型溫度敏感型淀粉基膠束提供了理論依據(jù),進(jìn)一步拓寬了木薯淀粉的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 工業(yè)級(jí),廣西武鳴安寧淀粉有限公司;聚乙二醇(PEG,Mn=4000) 分析純,廣東光華化學(xué)廠有限公司;羧基封端聚乙二醇 根據(jù)參考文獻(xiàn)步驟合成[20];丁二酸酐(SA) 分析純,阿拉丁;姜黃素、N-(3-二甲基氨丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP) 分析純,麥克林。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR) 美國Thermo 公司;Cary100紫外-可見分光光度計(jì) Agilent Technologies;冷凍干燥機(jī) 埃朗科技國際貿(mào)易(上海)有限公司;600 MHZ核磁共振波譜儀(1H-NMR)、透射電子顯微鏡(TEM) Hitachi日立;F-7000熒光分光光度計(jì) 日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 疏水淀粉(St-R)的制備 首先對(duì)木薯淀粉進(jìn)行降解處理[19],將原淀粉25 g,無水甲醇100 mL加入三口瓶中,然后滴加濃鹽酸4 mL,0.5 h后,加熱至50 ℃反應(yīng)5 h,冷卻至室溫后,先用碳酸鈉進(jìn)行中和,然后抽濾,用甲醇洗滌,干燥備用。

疏水化處理參照楊錦東[19]的方法,在裝有10 mL去離子水的三口瓶中加入5 g降解淀粉,攪拌條件下加入0.5 g的氫氧化鈉,隨后升溫至70 ℃,堿化反應(yīng)1 h。然后緩慢滴加12 g疏水醚化劑,繼續(xù)反應(yīng)5 h。待反應(yīng)結(jié)束后,冷卻到室溫,并用冰醋酸中和至中性,過濾。產(chǎn)物用50%丙酮反復(fù)洗滌數(shù)次,將析出的產(chǎn)品干燥后稱重保存以備后用。

1.2.2 疏水淀粉(St-R)接枝聚乙二醇共聚物的制備(R-St-mPEG)

1.2.2.1 羧基封端聚乙二醇的制備 參照文獻(xiàn)[20]中的方法,稱取3.8 g聚乙二醇(mPEG)、0.6 g丁二酸酐(SA)和0.01 g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100 mL 的二氯甲烷中,在25 ℃下攪拌48 h。旋蒸除去大量的二氯甲烷之后,反應(yīng)物用四氫呋喃溶解,然后用乙醚在分液漏斗中多次洗滌、沉降。最后真空干燥,得到羧基封端的聚合物mPEG-COOH。

1.2.2.2 疏水淀粉接枝聚乙二醇接枝的制備 參照文獻(xiàn)方法[21],將1 g疏水淀粉(St-R)和9.4 g羧基封端的聚乙二醇溶解在裝有60 mL二甲亞砜(DMSO)溶劑的反應(yīng)瓶中,在攪拌的條件下加入N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亞胺(EDC)0.72 g和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)0.023 g,反應(yīng)在常溫下反應(yīng)。隨后,溶劑和未反應(yīng)的反應(yīng)物通過透析除去。然后將溶液過濾,冷凍干燥即得烷基淀粉接枝聚乙二醇共聚物R-St-mPEG。

1.2.3 膠束溶液的制備 取1.2.2.2制備的聚合物100 mg于裝有100 mL PBS緩沖溶液的100 mL容量瓶中,室溫振搖48 h,100 W超聲10 min,使得聚合物在水溶液中充分分散。0.45 μm濾膜過濾,得澄清的膠束溶液。

1.2.4 測試及表征

1.2.4.1 傅里葉紅外變換光譜分析 取1～2 mg干燥的聚合物樣品,與50～100 mg干燥的KBr粉末混合,置于瑪瑙研缽中充分研磨,將研磨好的混合物粉末放入壓模中,在10 kPa的壓力下壓制成透明薄片,然后小心地將壓片取出,放入紅外光譜儀進(jìn)行測試,4000～5000 cm-1波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.4.2 核磁共振分析 稱取30～50 mg的聚合物,用DMSO-d6為溶劑在樣品管中溶解,為了使得樣品充分溶解,用超聲清洗器在100 W的功率條件下超聲10 min。最后將溶解好的樣品裝入核磁管,在室溫下檢測聚合物的氫譜。

1.2.4.3 臨界膠束濃度(CMC)測定 臨界膠束濃度的測定采用芘的熒光探針法分析。熒光探針芘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的配制(6×10-6mol/L):用分析天平準(zhǔn)確地稱取芘0.0012 g,燒杯中用適量丙酮溶解后轉(zhuǎn)入1 L容量瓶中,用丙酮定容并搖勻,配制得到濃度為6×10-6mol/L的芘丙酮貯備溶液,使用時(shí)在膠束水溶液中保持6×10-7mol/L的最終濃度。

膠束系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:分別取1 mL配制的芘丙酮溶液于幾個(gè)燒瓶中,讓其完全揮發(fā)備用。再稱取100 mg凍干材料粉末兩份分別于100 mL容量瓶中,加不同pH緩沖溶液溶解定容,取不同量上述膠束溶液進(jìn)行稀釋,配制成1～1×10-4mol/L不同濃度系列的膠束溶液。將不同濃度的膠束水溶液分別取10 mL,分別加入上述含芘的燒瓶中。

1.2.4.4 透射電鏡觀察 取1.2.3制備的膠束溶液滴于鋪有三百目銅篩的碳膜上,用濾紙除去多余水分,在自然條件下干燥,然后用加速電壓為80 kV掃描。

1.2.4.5 粒徑表征 采用激光納米粒度分析儀測定,用PBS緩沖溶液制備濃度為1.0 mg/mL的膠束溶液,取適量樣品加入比色皿中,參數(shù)設(shè)置為檢測器位置:173 °,溫度:25 ℃,淀粉折射率:1.53,緩沖溶液折射率:1.33。

1.2.5 負(fù)載性能的探究

1.2.5.1 負(fù)載膠束的制備 精確稱取25 mg姜黃素,將其置于燒杯中,用DMSO溶解后,將姜黃素的DMSO溶液移到250 mL容量瓶中,再用DMSO進(jìn)行定容,得到100 μg/mL的儲(chǔ)備液。精密移取2、3、4、5、6 mL 100 μg/mL的儲(chǔ)備液,將其分別移到100 mL的容量瓶中,用DMSO進(jìn)行定容,即制成2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用DMSO做空白對(duì)照液,分別在427 nm處測定其吸光度。W濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制姜黃素在DMSO中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取8～16 mg姜黃素溶于4 mL DMSO,另稱取100 mg 聚合物,溶于6 mL DMSO中,磁力攪拌使其完全溶解;在劇烈攪拌下,將4 mL姜黃素DMSO溶液緩慢滴入聚合物溶液中,室溫避光攪拌5 min,混合均勻,將混勻后液體轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)(透析膜截留分子量為3500 Da),對(duì)蒸餾水透析24 h,開始每隔12 h換水1次除去有機(jī)溶劑,5000 r/min離心除去藥物沉淀,得上清液,即為載姜黃素納米膠束。選取不同總投藥量(8、10、12、14、16 mg),固定材料每次用量為100 mg,以考察最大負(fù)載量。

式(1)

1.2.5.2 溫度響應(yīng)條件的研究 精確稱取25 mg姜黃素,用PBS緩沖液溶解,轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中,用PBS緩沖液定容,即得到100 μg/mL的藥物溶液,精密移取2、3、4、5、6 mL的藥物溶液到100 mL容量瓶定容,即制得濃度為2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用PBS做空白對(duì)照液,427 nm處測定吸收波長。繪制得到姜黃素在PBS中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取一定量的負(fù)載膠束,將其溶解在不同溫度的PBS緩沖溶液中(含0.5%吐溫80),使其濃度為1 mg/mL。量取5 mL的上述膠束溶液,裝入預(yù)先處理好的透析袋,再放置于30 mL的PBS緩沖溶液中,分別于25、37 ℃下恒溫振蕩(120 r/min)。間隔多次取樣,每次取樣4 mL,然后再補(bǔ)充4 mL新鮮的PBS緩沖溶液。用紫外分光光度計(jì)測定427 nm處的吸收波長,再根據(jù)姜黃素在PBS緩沖溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素在不同時(shí)間下的釋放量。累計(jì)釋放量可根據(jù)式(2)計(jì)算:

式(2)

式中,Cn:第n次取樣時(shí)的濃度;Cn-1:第n-1次取樣時(shí)的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均采用三組平行試驗(yàn)得出平均值,采用Excel 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與處理,并用軟件Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物(R-St-mPEG)的制備

木薯淀粉作為天然淀粉的一種,溶解性也相對(duì)較差,所以在制備木薯淀粉基聚合物膠束時(shí),選用二甲基亞砜作為反應(yīng)溶劑。由木薯淀粉制備聚合物膠束,為避免多基團(tuán)之間的相互反應(yīng),首先需要在淀粉分子骨架上引入疏水性基團(tuán)。異丙基縮水甘油醚不僅是良好的疏水化試劑,同時(shí)也是溫度敏感性的功能基團(tuán),可以使得聚合物形成疏水性內(nèi)核的同時(shí)使得淀粉基聚合物獲得溫度敏感性。反應(yīng)在堿催化下遵循親核取代機(jī)理進(jìn)行,淀粉在堿的催化下產(chǎn)生氧負(fù)離子,產(chǎn)生的氧負(fù)離子越多,親核取代也就越容易發(fā)生。其次,膠束的親水性外殼需要具有良好的生物相容性,聚乙二醇由于其突出的物化和生物性質(zhì)(無毒、無抗原性和無免疫原性)使其在制備兩親性聚合物時(shí)常常被作為一種可溶性的聚合物改性劑,用其所制得的聚合物有很高的兩親性,生物相容性和生物可降解性。聚乙二醇的特性滿足作為負(fù)載膠束親水外殼這一要求。根據(jù)酯化反應(yīng)機(jī)理,用羧基封端的聚乙二醇對(duì)淀粉進(jìn)行親水基的修飾。最終得到產(chǎn)物R-St-mPEG。合成過程如圖1所示。

圖1 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的合成路線圖Fig.1 The synthetise of starch based polymer(R-St-mPEG)

2.2 聚合物結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 傅里葉紅外變換光譜(FTIR)結(jié)果分析 聚合物紅外光譜如圖2所示,由圖2中可以得知,與原淀粉(St)紅外圖相比,疏水淀粉(St-R)譜圖發(fā)生了新的變化。在1014～1160 cm-1出現(xiàn)新的寬強(qiáng)峰,這是縮水甘油醚接枝淀粉后的醚鍵的特征吸收峰[21]。1646和1465 cm-1兩處的吸收峰屬于C-H的彎曲振動(dòng)[19]。3444 cm-1處的峰變強(qiáng)變寬,這是因?yàn)樵诘矸鄯肿渔溕弦肟s水甘油醚后新增加的羥基所引起的。而與淀粉接枝縮水甘油醚(St-R)相比,疏水淀粉接枝聚乙二醇(R-St-mPEG)的紅外譜圖也出現(xiàn)了新的變化。1735 cm-1出現(xiàn)了羰基的特征吸收峰,這是羧基封端聚乙二醇接枝到淀粉上的重要標(biāo)志。還有1110 cm-1處出現(xiàn)了明顯的酯鍵吸收峰[21]。此外,圖中2881～2977 cm-1之間的峰在不斷變寬變強(qiáng),這是由于淀粉分子上引入了烷基類基團(tuán)所導(dǎo)致的。這些證據(jù)都在一定程度上證明淀粉接枝聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。核磁共振氫譜和紅外變換光譜相輔才能進(jìn)一步證明聚合物的成功合成。

圖2 淀粉基聚合物(R-St、R-St-mPEG)及原淀粉(St)紅外光譜圖(FTIR)Fig.2 The infrared spectrum(FTIR)of starch-based polymer(R-St,R-St-mPEG)and starch(St)

2.2.2 核磁共振氫譜(1H-NMR)結(jié)果 利用核磁共振氫譜對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步表征,如圖3為淀粉基聚合物的核磁共振氫譜圖。由圖中則可以看出淀粉葡萄糖環(huán)(AGU)上各氫的質(zhì)子峰都可以被明顯的觀察到,分別是5.6 ppm(20)、5.3 ppm(19)以及5.1 ppm(1)位置處的三個(gè)質(zhì)子峰。除此之外,出現(xiàn)在化學(xué)位移δ=3.51和3.23 ppm處的質(zhì)子峰分別歸屬于mPEG上的亞甲基和末端甲基,這些結(jié)果與文獻(xiàn)對(duì)照一致[22]。淀粉分子骨架上除了親水性的聚乙二醇(mPEG)之外,還引入了疏水性的縮水甘油醚,根據(jù)文獻(xiàn)可知[21,23],異丙基縮水甘油醚亞甲基中(H14,H15)的各質(zhì)子峰出現(xiàn)在3.0～3.8 ppm之間,H17、H18出現(xiàn)在0.75 ppm附近,以及1.4和1.5 ppm附近的H16。這些證據(jù)都證明聚合物中接枝的各個(gè)基團(tuán)都出現(xiàn)在了產(chǎn)物中,與紅外光譜中特征官能團(tuán)的譜圖共同證明了聚合物(R-St-mPEG)的成功合成。

圖3 淀粉基聚合物(R-St-mPEG)的核磁共振氫譜圖(1H-NMR)Fig.3 Nuclear magnetic resonance spectrum ofstarch-based polymer(R-St-mPEG)

2.3 臨界膠束濃度(CMC)測定結(jié)果

臨界膠束濃度是證明膠束自組裝行為發(fā)生的重要參數(shù),同時(shí)也能夠說明藥物載體在體內(nèi)長效循環(huán)中的穩(wěn)定性[24]。以芘做熒光探針,當(dāng)芘從親水環(huán)境轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境的過程中,當(dāng)聚合物濃度達(dá)到某個(gè)值的時(shí)候芘的熒光強(qiáng)度發(fā)生突變,這個(gè)濃度被定義為臨界膠束濃度(CMC)。如圖4所示,以芘的熒光強(qiáng)度比值(I318/I332)和聚合物濃度的對(duì)數(shù)(Log C)作圖,圖中拐點(diǎn)所示即為聚合物R-St-mPEG的臨界膠束濃度。拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度為0.339 mg/mL。說明當(dāng)聚合物膠束在溶液中的濃度達(dá)到0.339 mg/mL時(shí),聚合物便能發(fā)生自組裝行為。疏水性基團(tuán)向內(nèi)卷曲形成疏水內(nèi)核,親水性基團(tuán)向外部排列形成親水性外殼。此外,臨界膠束濃度(CMC)的測定為聚合物膠束負(fù)載功能性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ),當(dāng)膠束發(fā)生自組裝行為時(shí),可以與姜黃素溶液混合,將姜黃素分子成功包裹進(jìn)膠束的疏水內(nèi)核中。

圖4 芘的熒光強(qiáng)度比值與膠束濃度對(duì)數(shù)圖Fig.4 Pyrene fluorescence intensity ratioand micelle concentration logarithm plot

2.4 聚合物(R-St-mPEG)透射電鏡(TEM)結(jié)果表征

透射電鏡可以對(duì)膠束的形貌進(jìn)行表征,由于人體正常組織環(huán)境pH為7.4,所以為了保證膠束負(fù)載后進(jìn)入體內(nèi)能夠穩(wěn)定輸送藥物,選用在pH7.4的磷酸緩沖液中對(duì)膠束分散后觀察其形貌。圖5所示為膠束在pH=7.4 PBS緩沖溶液中50 h后的形貌圖。由圖中可以看到,膠束呈現(xiàn)球形和橢球型結(jié)構(gòu),粒徑不均一。膠束在存放50 h后仍舊能夠保持球形結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生坍塌或者破裂,這為后續(xù)膠束的負(fù)載提供了有利的穩(wěn)定環(huán)境。負(fù)載膠束在進(jìn)入人體后若是發(fā)生結(jié)構(gòu)的坍塌或者破裂,將導(dǎo)致提前釋放和削弱膠束的緩釋效果。此外,透射電鏡結(jié)果也表明了通過自組裝行為形成了球形結(jié)構(gòu)。

圖5 聚合物膠束的透射電鏡(TEM)圖Fig.5 TEM of polymer micelles

2.5 聚合物粒度分析

聚合物膠束作為藥物載體,其粒徑小于200 nm時(shí),膠束能夠顯示出較好增強(qiáng)滲透性和滯留(EPR)效應(yīng)[27]。通過馬爾文激光納米粒度散射儀可以測量聚合物膠束在溶液中粒徑,圖6所示為聚合物膠束在pH=7.4的緩沖溶液中的粒徑分布圖。粒徑集中分布在28和122 nm附近。粒徑分布不均一主要是聚合物基材淀粉的性質(zhì)所導(dǎo)致的,淀粉本身粘度大,淀粉之間容易發(fā)生粘連[28],當(dāng)?shù)矸鄯肿又g發(fā)生粘連時(shí),勢必會(huì)造成粒徑測量結(jié)果較大。此外,膠束的粒徑分布不均一與透射電鏡結(jié)果也相符,這也證明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

圖6 膠束的粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution of micelles

2.6 負(fù)載性能分析

為了獲得負(fù)載膠束中姜黃素的載藥量(DLC),稱取一定量負(fù)載有姜黃素的負(fù)載膠束溶解在DMSO中,利用紫外可見分光光度計(jì)測定波長在427 nm處的吸光強(qiáng)度,然后再通過姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算濃度,姜黃素在DMSO中標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合良好。如圖8所示為不同投藥量膠束的載藥量,根據(jù)1.2.5.1中的式1計(jì)算可得,當(dāng)材料投入100 mg,姜黃素投入量為14 mg時(shí),膠束有最大負(fù)載量,負(fù)載量為18.47%。聚合物的投入量與藥物濃度之間有著密切的聯(lián)系,當(dāng)藥物濃度較小時(shí),膠束在形成時(shí),藥物不能完全占據(jù)膠束的內(nèi)核空間,導(dǎo)致負(fù)載量不能達(dá)到飽和。當(dāng)逐步增大藥物濃度時(shí),負(fù)載量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,這是由于姜黃素在水中的穩(wěn)定性較差[25],隨著DMSO不斷透析被除去,聚合物還未在水溶液中形成核-殼結(jié)構(gòu)的膠束時(shí),姜黃素便已經(jīng)結(jié)晶析出,姜黃素發(fā)生聚集,導(dǎo)致負(fù)載量也隨著姜黃素濃度的增大而出現(xiàn)減小趨勢。所以聚合物材料的投加與藥物濃度之間需要有合適的比例。

圖7 姜黃素在DMSO中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of curcumin in DMSO

圖8 不同投藥量下的膠束負(fù)載量Fig.8 Micelle loads at different dosages

2.7 聚合物膠束的溫敏性能考察

人體內(nèi)各組織之間的溫度也會(huì)存在一定的差異,腫瘤組織的溫度明顯高于人體正常體溫,這也為開發(fā)溫度敏感型的負(fù)載膠束提供了先決條件。溫度敏感型聚合物膠束的釋放機(jī)理主要與外界環(huán)境的溫度有關(guān),當(dāng)溫度高于聚合物的臨界溫度時(shí),聚合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致膠束的核-殼結(jié)構(gòu)收縮從而釋放。當(dāng)溫度對(duì)于臨界溫度時(shí),聚合物膠束分子上的羥基、氧、烷氧基等與溶液中的水分子形成氫鍵,膠束的核殼結(jié)構(gòu)也會(huì)更加穩(wěn)定,功能性物質(zhì)姜黃素通過擴(kuò)散和滲透作用[26]從膠束中進(jìn)行釋放。根據(jù)上述機(jī)理,采用常溫和人體外環(huán)境溫度兩個(gè)條件下考察淀粉基聚合物R-St-mPEG的溫度敏感性和緩釋性能。首先繪制了姜黃素在磷酸緩沖液(PBS)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖9),線性擬合度良好。間隔不用時(shí)間取樣,然后測定溶液的吸光度,根據(jù)式2計(jì)算負(fù)載膠束的累計(jì)釋放量,并以時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖(如圖10)。由圖中可以看出33 h以前,25 ℃環(huán)境中的膠束累計(jì)釋放量大于37 ℃環(huán)境中的累計(jì)釋放量,這是由于37 ℃環(huán)境中的負(fù)載膠束會(huì)經(jīng)歷膠束球形結(jié)構(gòu)收縮的過程,膠束更加緊密,導(dǎo)致藥物通過擴(kuò)散和滲透方式釋放變慢。30～52 h之間,37 ℃環(huán)境中的膠束大于收縮更加緊密膠束中的藥物通過“擠出”方式釋放,產(chǎn)生突釋效應(yīng),累計(jì)釋放量變大。而25 ℃環(huán)境中的膠束一直處于平穩(wěn)的釋放階段,沒有突釋階段,這也符合膠束通過擴(kuò)散和滲透作用逐步釋放的機(jī)理。60 h內(nèi)37 ℃環(huán)境中的膠束累計(jì)釋放量達(dá)到了43.9%,25 ℃環(huán)境中的負(fù)載膠束累計(jì)釋放量只有34.7%。負(fù)載膠束的累計(jì)釋放結(jié)果表明淀粉基聚合物R-St-mPEG具備溫度敏感性能,隨著溫度的升高釋放量也會(huì)不斷增加。

圖9 姜黃素在PBS緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of curcumin in PBS buffer

圖10 負(fù)載膠束在不同環(huán)境中的釋放曲線Fig.10 Release curves of loadedmicelles in different environments

3 結(jié)論

本研究首先用異丙基縮水甘油醚改性木薯淀粉制備了疏水化淀粉R-St,然后用生物相容性好的親水性基團(tuán)mPEG進(jìn)行修飾,得到了一種新型兩親性的淀粉基聚合物R-St-mPEG。利用芘的熒光探針法表征了聚合物的自組裝行為,當(dāng)聚合物膠束濃度達(dá)到0.339 mg/mL時(shí),膠束能夠發(fā)生自組裝行為。利用透射電鏡進(jìn)一步表征膠束的形貌,發(fā)現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)球形和橢球形。為了探明膠束的粒徑,利用馬爾文激光納米粒度散射儀對(duì)膠束粒徑進(jìn)行測定,膠束粒徑集中分布在兩個(gè)區(qū)域,28和122 nm,與透射電鏡結(jié)果相符。此外,通過負(fù)載抗癌藥物姜黃素考察了膠束的負(fù)載性能,膠束與姜黃素之間需要合適的比例才能夠達(dá)到最大負(fù)載量,當(dāng)膠束投加量為100 mg,姜黃素投加量為14 mg時(shí),聚合物膠束具有最大負(fù)載量為18.47%。體外釋放結(jié)果表明聚合物膠束(R-St-mPEG)釋放是一個(gè)緩慢而穩(wěn)定的過程,在溫度較高的條件下,聚合物膠束的釋放速度明顯較快,37 ℃環(huán)境中,膠束60 h內(nèi)累計(jì)釋放量為43.9%,而在25 ℃環(huán)境中,60 h內(nèi)膠束的累計(jì)釋放量為34.7%。證明聚合物膠束具有溫度響應(yīng)性。本研究證明兩親性聚合R-St-mPEG膠束能夠有效包裹和釋放藥物,能夠成為有效的藥物載體。