韓子晗,孫 堯,楊富雅,高 冷

(長春工業(yè)大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012)

東北林蛙(RanatemporariachensinensisensisDavid),簡稱林蛙,又稱雪蛤,俗稱田雞、哈士蟆,屬兩棲綱、無尾目、蛙科、林蛙屬,廣泛分布于我國中北部,主產(chǎn)于我國黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古。中國林蛙體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、糖類以及多種維生素和激素等營養(yǎng)成分[1],具有重要的保健功能[2]。林蛙卵是林蛙油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物之一,林蛙卵的年產(chǎn)量大且未能得到充分利用逐漸得到關注。林蛙卵油中含有豐富的不飽和脂肪酸成分[3-4],林蛙卵油具有抗驚厥[5]、抗焦慮[6]和調(diào)節(jié)血脂[7]等作用。近幾年,國外對于林蛙的研究微乎其微,對于林蛙卵油的研究尚未查閱到相關文獻,國內(nèi)劉俊梅等[8]對林蛙卵的營養(yǎng)成分和保健功效進行了系統(tǒng)分析,陳寧寧等[9]對林蛙卵油進行成分分析,并利用脂肪酸的乳化性質(zhì)在化妝品領域進行產(chǎn)品研制。

CO2是一種無毒、純度高、可再循環(huán)利用的溶劑,是超臨界流體提取技術最常用的溶劑[10-11]。與常見的有機溶劑提取法相比,超臨界流體提取物中沒有溶劑殘留,同時CO2的臨界壓力與臨界溫度較為溫和,提取過程可以在較低的壓力溫度下進行,不會對熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響,更不會引起部分物質(zhì)的氧化[12]。作為一種環(huán)境友好型技術,超臨界流體提取被應用于各種科學和工業(yè)生產(chǎn)領域[13]。楊小斌等[14]研究了超臨界二氧化碳萃取藍圓鲹魚油的工藝條件,探究了不同提取條件對藍圓鲹魚油提取率的影響;Nuria等[15]使用超臨界二氧化碳對魚油進行提取,并與其它方法進行了比較。

氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用靈敏度較高、抗干擾能力強,在化學、生物領域具有廣泛的應用[16-18]。肖井雷等[19]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的方法,對林蛙油中激素類成分進行了測定。

本文采用超臨界CO2提取法從林蛙卵中提取林蛙卵油,以單因素實驗為基礎,研究不同的提取因素對林蛙卵油提取率的影響,后續(xù)進行正交試驗設計和極差分析,得出各因素之間的交互作用,確定不同因素對林蛙卵油提取率的影響強弱,對最佳提取工藝進行優(yōu)化。采用GC-MS對林蛙卵油的成分進行檢測分析,鑒定其主要成分,進而對其進行抗氧化活性研究[20-21],為更好地開發(fā)并利用林蛙卵油提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

林蛙卵 長春工業(yè)大學化學與生命科學實驗室;正己烷 分析純,天津市富宇精細化工有限公司;氫氧化鈉、甲醇、乙醚、氫氧化鉀、無水乙醇、鹽酸、氯化鈉 分析純,北京化工廠;水楊酸、鄰苯三酚 分析純,天津市光復精細化工有限公司;硫酸亞鐵 分析純,廊坊科瑞化工有限公司;過氧化氫 分析純,西隴化工股份有限公司;Tris(生化試劑) 上海展云化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司。

SCION SQ氣質(zhì)聯(lián)用儀 上海冉超光電科技有限公司;HA221-50-06超臨界CO2提取儀 江蘇華安科技有限公司;AE1012031紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;CO2鋼瓶(40 L) 沈陽鑫東基化工氣體有限公司;MixPlus漩渦振蕩器 南京東邁科技儀器有限公司;JE101電子天平 上海浦春計量儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 林蛙卵油的提取

1.2.1.1 原料預處理 將林蛙卵除雜后放至超聲波清洗儀(40 kHz,30 ℃下超聲清洗30 min)中清洗,再進行真空干燥,相對真空度0.09 MPa,溫度90 ℃干燥至表面不含水分,使用粉碎機進行粉碎,-20 ℃放置備用。

1.2.1.2 林蛙卵油提取工藝 稱取1 kg經(jīng)過預處理的干燥林蛙卵原料裝入提取釜中,加蓋擰緊,裝入反應容器中,控制單因素實驗條件,在一定的溫度、一定的壓力、一定的時間和一定的CO2流量進行提取,通過收集林蛙卵油,計算提取率,確定最佳單因素范圍。

1.2.1.3 單因素實驗 a:提取溫度對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取壓力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取溫度分別為40、45、50、55、60、65和70 ℃,提取林蛙卵油,研究提取溫度對林蛙卵油提取率的影響。

b:提取壓力對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取溫度55 ℃,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取壓力分別為15、20、25、30、35、40和45 MPa,提取林蛙卵油,研究提取壓力對林蛙卵油提取率的影響。

c:提取時間對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預處理過的林蛙卵原料,控制提取溫度55 ℃,提取壓力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取時間分別為60、90、120、150、180、210和240 min,提取林蛙卵油,研究提取時間對林蛙卵油提取率的影響。

d:CO2流量對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取溫度55 ℃,提取壓力30 MPa,改變CO2流量分別為4、6、8、10、12、14和16 L/h,提取林蛙卵油,研究CO2流量對林蛙卵油提取率的影響。

1.2.1.4 正交試驗 在單因素實驗的基礎之上,篩選出對提取率影響較大的因素:提取溫度、提取壓力、提取時間、CO2流量,并以林蛙卵油提取率為檢驗指標,進行L9(34)正交試驗設計,正交實驗設計因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 Factor and level of Orthogonal test L9(34)

1.2.1.5 林蛙卵油提取率測定方法 使用電子天平稱量出干燥林蛙卵的質(zhì)量,記為m2,使用超臨界CO2提取,提取完成稱量林蛙卵油質(zhì)量,記為m1,根據(jù)公式計算出林蛙卵油提取率X。林蛙卵油提取率公式為:

式(1)

式中,X:林蛙卵油的提取率(%);m1:林蛙卵油的質(zhì)量(g);m2:干燥林蛙卵的質(zhì)量(g)。

1.2.2 脂肪酸組成的檢測方法

1.2.2.1 林蛙卵油樣品前處理 準確稱取提取后的林蛙卵油0.20 g,加入正己烷使林蛙卵油完全溶解并定容在10.00 mL容量瓶中,搖勻后用移液槍移取50 μL于10 mL試管中,加入0.4 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液2.00 mL后,放置在漩渦振蕩器中,振蕩2 min,放置10 min,再加入1.95 mL正己烷于試管中,將其放入旋渦振蕩器振蕩2 min,讓后用質(zhì)量分數(shù)為8.0%的氯化鈉溶液稀釋至10 mL,以2000 r/min離心10 min后吸出上清液于微量試管中,過0.45 μm的微孔濾膜過濾,再經(jīng)過三氟化硼法進行脂肪酸的甲酯化處理[22],最后取1 μL樣品進行GC-MS分析。

1.2.2.2 色譜條件 DB-5MS毛細管柱(30 mm×0.25 μm×0.25 nm),進樣口溫度250 ℃;程序升溫:90 ℃持續(xù)1 min,以5 ℃/min至140 ℃,再以以3 ℃/min至170 ℃,持續(xù)1 min,最后以10 ℃/min至250 ℃,持續(xù)5 min。載氣:高純氦氣;流量1 mL/min;分流比:40∶1。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件 EI+離子源,離子能量70 eV;燈絲流量0.2 mA;離子源溫度:230 ℃;接口溫度:250 ℃;掃描質(zhì)量范圍:10～550 amu。

1.2.2.4 圖譜分析 GC-MS數(shù)據(jù)的定性分析:樣品經(jīng)過 GC-MS分析后,以峰的保留時間及譜庫檢索進行定性分析,然后與相應標準峰面積進行比較完成定量分析得出林蛙卵油主要的化學成份。

1.2.3 抗氧化活性

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的測定 依據(jù)賀銀菊等[23]的描述,配制1 mmol/L的DPPH溶液,放置在4 ℃冰箱中備用。實驗前,用無水乙醇將配制好的溶液稀釋至0.2 mmol/L使用。取1～8號試管中分別加入不同濃度的林蛙卵油作為實驗組,9號試管作為對照組,依次測定在519 nm處的吸光度值。

DPPH自由基清除率(I,%)公式

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(2)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實驗樣品組的吸光度值。

1.2.3.2 羥基自由基清除率的測定 采用水楊酸乙醇-分光光度法[24]并做適當改進,測定林蛙卵油對羥基自由基的清除能力,取1～8號為樣品組、9號為空白組、10～17號為不加顯色劑的對照組。1～8號試管中分別加入1 mL不同濃度的林蛙卵油,再依次加入1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,11 mL去離子水以及1 mL的過氧化氫溶液。向9號管中添加1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,12 mL去離子水以及1 mL的過氧化氫溶液。向10～17號管中分別添加1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,12 mL去離子水以及各濃度的林蛙卵油。水浴15 min后取出,在510 nm處依次測定反應后各溶液吸光度值。

I(%)=[A0-(A1-AX)]/A0×100

式(3)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實驗樣品組的吸光度值;AX為不加顯色劑對照組的吸光度值。

1.2.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 參考Siswoyo等[25]的方法,取1～8號試管中分別加入2 mL不同濃度的林蛙卵油作為實驗組,9號試管中加入2 mL去離子水作為對照組,再加入5.0 mL Tris-HCl緩沖溶液,充分混勻,37 ℃水浴10 min,加入1.0 mL鄰苯三酚溶液,充分反應6 min,迅速加入0.5 mL HCl終止反應。依次測定反應后各溶液在420 nm處的吸光度值。

超氧陰離子自由基清除率(I,%)公式:

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(4)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實驗樣品組的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2超臨界提取條件單因素實驗結(jié)果

由圖1A可以看出,溫度低于60 ℃時,提取溫度升高使分子間的熱運動加劇,傳質(zhì)效率和擴散系數(shù)增加,從而增加CO2流體的溶解度,提取率也隨之升高。而當溫度高于60 ℃時,溫度升高,CO2流體的密度降低,導致其溶解能力降低,提取率也隨之降低[26]。因此溫度選擇為55、60、65 ℃。

由圖1B可以看出,在提取過程中當壓力低于35 MPa時,CO2流體的密度隨著壓力的升高而增加,不斷接近林蛙卵油的密度而發(fā)揮CO2的脂溶性,根據(jù)相似相溶原理,林蛙卵油在CO2流體中的溶解度不斷增加,從而使提取率快速升高。當壓力達到35 MPa時,繼續(xù)升高壓力,溶解度基本達到飽和狀態(tài),林蛙卵油的溶解量幾乎不再增加,提取率增加變緩,甚至不變[27]。因此提取壓力選擇為30、35、40 MPa。

由圖1C可以看出,當提取時間小于150 min時,CO2流體對物料浸提不完全,提取率低,提取時間增加,CO2流體與物料充分接觸,使浸提充分,所以能迅速地提高提取率。當提取時間達到150 min后,物料已基本被充分提取,再增加提取時間對提取率影響不大[28]。因此提取時間選擇為150、180、210 min。

由圖1D可以看出,當CO2流量增大,提取釜入口處的CO2流速增大,提取釜中CO2的流動方向由于卷吸效應發(fā)生彎曲,CO2流量越大,卷吸效應越強,使得提取釜中的原料與超臨界CO2充分反應,使提取速率不斷升高。當CO2流量超過10 L/h時,提取率變化不大。因此CO2流量選擇為8、10、12 L/h。

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig.1 The result of single factor experiment

根據(jù)圖1所示的曲線,從量化生產(chǎn)的經(jīng)濟方面考慮,為了提高林蛙卵油的提取率,同時又降低能源損耗,選取提取溫度在55～65 ℃,最適提取壓力在30～40 MPa之間,最適提取時間在150～210 min之間,最適CO2流量在8～12 L/h之間。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎上,采用四因素三水平的的正交設計方案,在9種不同工藝條件下提取林蛙卵油,分別測定其提取率,結(jié)果見表2。表2的極差分析結(jié)果表明,超臨界提取4個因素對林蛙卵油提取率的影響順序為:提取壓力>提取溫度>CO2流量>提取時間。綜合考慮,林蛙卵油的最佳提取方案為A2B2C1D2,即最佳提取工藝條件組合為提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 正交試驗最佳提取條件驗證

在上述最佳條件下(提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min)進行3次重復試驗,其林蛙卵油提取率分別為34.36%、34.18%和34.24%,得到平均提取率為34.26%±0.09%,由提取率可看出,最佳提取工藝條件具有較好的重復性,林蛙卵油提取率較高,說明該工藝條件是合理的、可靠的。

2.4 林蛙卵油成分分析結(jié)果

采用GC-MS分析法對CO2超臨界提取法所得到的林蛙卵油脂肪酸甲酯液進行分析,得林蛙卵油油脂肪酸甲酯色譜圖,如圖5所示。同時采用面積歸一化法定量分析計算出各成分的相對含量,結(jié)果見表3。由表3可知,林蛙卵油中共鑒定出34種脂肪酸,其飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為31.95%、68.05%。十六烷酸為7.65%、十六碳一烯酸為14.66%、十八碳烯酸(油酸)為27.94%、二十碳五烯酸(EPA)為8.85%及二十二碳六烯酸(DHA)為2.32%。

圖2 林蛙卵油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2 Fatty acids methyl esterschromatogram of Rana chensinensis egg oil

表3 林蛙卵油脂肪酸成分與含量Table 3 Compositions and contents offatty acids in Rana chensinensis egg oil

如圖3,VC清除DPPH自由基能力隨濃度升高而增加,當VC濃度為0.8 mg/mL后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除DPPH能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL后繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行分析,得出VC對DPPH自由基清除能力IC50值為0.289 mg/mL,林蛙卵油對DPPH自由基清除能力IC50值為0.897 mg/mL。

圖3 林蛙卵油濃度對DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on DPPH free radicals

如圖4所示,VC清除羥基自由基能力隨濃度升高而增加,當VC濃度為0.8 mg/mL時,清除率達到最大值,后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除羥基自由基能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL時繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行分析,VC對羥基自由基清除能力IC50值為0.317 mg/mL,林蛙卵油對羥基自由基清除能力IC50值為1.392 mg/mL。

圖4 林蛙卵油濃度對羥基自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on hydroxyl free radicals

如圖5所示,VC清除超氧陰離子自由基能力隨濃度升高而增加,當VC濃度為1.0 mg/mL后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除超氧陰離子自由基能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL時繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行分析,VC對超氧陰離子自由基清除能力IC50值為0.457 mg/mL,林蛙卵油對超氧陰離子自由基清除能力IC50值為1.687 mg/mL。

圖5 林蛙卵油濃度對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on superoxide anion free radicals

通過與呂培霖等[29]研究的紅花籽油、樊梓鸞等[30]研究的紅松松針精油、梁美融等[31]研究的花椒精油相比,相同濃度的林蛙卵油抗氧化活性更加優(yōu)良。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交試驗確定超臨界CO2法提取林蛙卵油的最佳提取工藝為:提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min,此時林蛙卵油的提取率為34.26%。在此條件下采用GC-MS分析法對林蛙卵油脂肪酸甲酯液的成分進行檢測,確定其含有34種脂肪酸,其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為31.95%和68.05%,主要脂肪酸有十六烷酸、十六碳一烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)。通過抗氧化活性研究試驗表明,林蛙卵油對DPPH自由基的IC50值為0.897 mg/mL,對羥基自由基的IC50值為1.392 mg/mL,對超氧陰離子的IC50值為1.687 mg/mL。林蛙卵油具有較強的體外抗氧化活性,在天然抗氧化劑和保健食品中有良好的開發(fā)利用價值。