黃晶， 付佳

（1.孝感市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 孝感 432000；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

異體輸血是圍手術(shù)期治療的重要手段［1］。然而，異體輸血引起機(jī)體多種不良反應(yīng)的問題也受到越來越多的關(guān)注［2］。以往對輸血副作用的認(rèn)識多局限在溶血性輸血反應(yīng)和疾病傳播，而對輸血造成的免疫抑制作用認(rèn)識不足［3］。有研究結(jié)果表明，血液作為一種免疫原性和反應(yīng)原性物質(zhì)，在輸血過程中會伴隨產(chǎn)生一系列涉及免疫調(diào)節(jié)的副反應(yīng)，稱之為輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)效應(yīng) （transfusion-relelated immunomodulation， TRIM）［4］。 異體輸血對受血者機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用是相當(dāng)廣泛的，涉及體內(nèi)多種免疫細(xì)胞數(shù)量及其功能、淋巴細(xì)胞不同亞群之間的比例失調(diào)、各類免疫球蛋白含量變化、細(xì)胞因子濃度消長、補(bǔ)體系統(tǒng)分子濃度變化等多方面的改變［5］。然而，對于腫瘤患者而言，免疫功能的變化是腫瘤患者在術(shù)后能否徹底清除腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵因素。因此有學(xué)者根據(jù)臨床研究結(jié)果，提出了輸血可能導(dǎo)致腫瘤手術(shù)后癌腫復(fù)發(fā)率增高、增加死亡風(fēng)險的假說［6］，并且得到隨后進(jìn)一步研究的證實［7］。與異體輸血比較，圍手術(shù)期自體輸血方法不僅在避免疾病傳播、溶血性輸血反應(yīng)、發(fā)熱及過敏、移植物抗宿主反應(yīng)等方面明顯優(yōu)于對照，而且能夠明顯降低或消除輸血對患者免疫功能的抑制作用［2］。因此，探討圍手術(shù)期異體輸血與自體輸血對患者免疫系統(tǒng)的影響意義重大。

本研究通過對我院圍手術(shù)期需要輸血的婦科惡性腫瘤患者進(jìn)行等容稀釋自體輸血和異體輸血，然后測量不同時段外周血中免疫物質(zhì)含量的變化，分析兩種輸血方式對腫瘤患者T淋巴細(xì)胞及其亞群、細(xì)胞因子的變化，為腫瘤患者圍手術(shù)期選擇合理輸血方式、科學(xué)地分析其對腫瘤患者術(shù)后免疫狀態(tài)的影響提供必要的理論依據(jù)和臨床研究資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月至2019年4月孝感市中心醫(yī)院收治的實施婦科惡性腫瘤根治術(shù)的患者60例為研究對象，將患者隨機(jī)分為觀察組和對照組，各30例，其中觀察組采用等容稀釋自體輸血，對照組采用異體輸血。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者在手術(shù)前3個月內(nèi)均無輸血史，且術(shù)前及術(shù)后30 d內(nèi)均未予放、化療和免疫治療。所有患者術(shù)前血紅蛋白＞120 g／L，紅細(xì)胞比容＞35%。排除標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)分泌及免疫性疾病者；血源性傳染病者。2組患者的年齡、術(shù)中出血量、輸血量、手術(shù)時間、腫瘤類型及術(shù)式差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），見表1。2組患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 2組患者一般資料及手術(shù)概況比較 （±s）

表1 2組患者一般資料及手術(shù)概況比較 （±s）

組別 n 年齡 （歲） 失血量 （ml） 輸血量 （ml） 手術(shù)時間 （min） 腫瘤類型 術(shù)式對照組 30 65.36±4.87 273±91 400±50 194±40 惡性 根治術(shù)觀察組 30 65.41±4.69 276±95 400±50 196±42 惡性 根治術(shù)

1.2 方法 2組患者手術(shù)均采用靜脈復(fù)合麻醉。觀察組患者，麻醉后術(shù)前經(jīng)橈動脈采血400～600 ml，同時經(jīng)靜脈輸入相當(dāng)容量的羥乙基淀粉，術(shù)中根據(jù)情況將自身血回輸。對照組患者，輸異體全血400～600 ml。2組患者均在術(shù)前，以及術(shù)后第1天、第7天分別取外周靜脈血4 ml／次，每2 ml置于1個EDTA-K2抗凝試管中，共2管，即刻送到檢驗科 （注：用于測定T淋巴細(xì)胞亞群的抗凝血無需離心，4℃冷藏備用，使用前充分混勻；用于測定細(xì)胞因子的抗凝血，3 000 r／min離心30 min取上清，-80℃凍存，備用）。

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞 （1）免疫熒光標(biāo)記T淋巴細(xì)胞?；靹蚯笆隼洳貍溆玫目鼓?，加100μl全血于試管中，分別加入抗人CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP以及 CD4-APC單克隆熒光抗體各20μl，用振蕩器充分混勻后，4℃，避光孵育20 min，4℃保存?zhèn)溆?。?）流式細(xì)胞儀檢測分析 （儀器型號及配套試劑生產(chǎn)廠家：美國BD公司FACSCalibur，試劑：美國BD公司淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒）。檢測前，流式細(xì)胞儀采用BD Calibrite標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，按照FACSComp程序，校準(zhǔn)熒光通道FL1（標(biāo)記物—FITC異硫氰酸熒光素）、FL2（標(biāo)記物—PE藻紅蛋白）、FL3（標(biāo)記物—PerCP多甲藻黃素）、FL4（標(biāo)記物—APC別藻藍(lán)蛋白）及側(cè)向散射光（SSC）、前向散射光 （FSC）通道的準(zhǔn)確性。上述染色后細(xì)胞，用BD Lysing solution溶血素破壞紅細(xì)胞后，上機(jī)運(yùn)行和獲取≥10 000的顆粒事件。利用含已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)微球的絕對計數(shù)管進(jìn)行絕對計數(shù)，結(jié)果用雙參數(shù)散點圖表示。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測 采用ELISA方法通過酶標(biāo)儀對血清中的細(xì)胞因子 （IL-2、IL-10、IFN-γ）進(jìn)行檢測分析 （儀器及配套試劑生產(chǎn)廠家：奧地利貝利公司，型號：BL Ecsys）。（1）酶標(biāo)孔板為48孔，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl；（2）樣本孔先加待測樣本10μl， 再加樣本稀釋液40μl； 空白孔不加。 （3）除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶 （HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。（4）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次 （也可用洗板機(jī)洗板）。（5）每孔加入底物 A、B各 50μl，37℃避光孵育 15 min。 （6） 每孔加入終止液50μl，15 min內(nèi)， 通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。（7）通過酶標(biāo)儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。其中IL-2的參考值為15～100 pg／ml， IL-10的參考值為＜5 pg／ml， IFN-γ 的參考值為 15～200 pg／ml。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者T細(xì)胞及各T細(xì)胞亞群構(gòu)成比的變化情況比較 其中1例患者雙參數(shù)散點圖舉例見圖 1。 術(shù)后第 1天，2組患者的 CD3＋、CD4＋、CD8＋細(xì)胞數(shù)占T細(xì)胞百分比與術(shù)前相比均顯著減少 （P＜0.05）； 術(shù)后第7天， 對照組患者的CD3＋、CD4＋、CD8＋細(xì)胞 （外周血中極少存在雙陽性T細(xì)胞）所占百分比顯著少于同組術(shù)前 （P＜0.05），觀察組與同組術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）； 觀察組患者 CD3＋、 CD4＋、 CD8＋細(xì)胞數(shù)在T細(xì)胞中所占百分比明顯高于對照組 （P＜0.05），見表2。

表2 2組患者T淋巴細(xì)胞亞群占比的變化情況 （±s，%）

表2 2組患者T淋巴細(xì)胞亞群占比的變化情況 （±s，%）

注：與同組術(shù)前比較，1）P＜0.05；與對照組比較，2）P＜0.05。CD3＋、CD4＋、CD8＋細(xì)胞所代表的數(shù)值是各細(xì)胞占T細(xì)胞的百分比

時間 組別 n CD3＋ CD4＋ CD8＋術(shù)前 對照組 30 65.1±4.1 58.2±5.3 31.7±4.7觀察組 30 67.2±5.1 59.9±4.8 32.4±4.3術(shù)后第1天 對照組 30 52.1±5.4 1） 50.7± 3.91） 23.7±4.31）觀察組 30 62.7±5.3 1） 52.7±5.1 1） 27.1±3.9 1）術(shù)后第7天 對照組 30 51.7±4.51） 46.0±5.21） 22.4±4.21）觀察組 30 65.1±4.72） 57.4±4.92） 30.4±4.62）

2.2 2組患者細(xì)胞因子的變化情況 術(shù)后第1天，觀察組患者IL-2、IFN-γ水平，對照組患者IL-10水平較本組術(shù)前顯著升高 （P＜0.05）；對照組患者IL-2、IFN-γ水平，觀察組患者IL-10與本組術(shù)前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。術(shù)后第7天，觀察組患者細(xì)胞因子水平與術(shù)前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），對照組患者IL-2、IFN-γ水平較術(shù)前顯著減少，IL-10水平較術(shù)前顯著增加 （P＜0.05）； 觀察組患者的IL-2、IFN-γ水平顯著高于對照組患者 （P＜0.05），2組IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3 討論

免疫功能高低對于腫瘤患者的預(yù)后十分重要，異體輸血可能使被輸血的腫瘤患者免疫功能受到抑制，增加患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率，使其存活時間縮短［8］。

T細(xì)胞亞群在腫瘤免疫監(jiān)視中起重要作用，對判斷腫瘤的發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸有著重要意義。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第7天對照組CD3＋、CD4＋、CD8＋比觀察組顯著下降，提示術(shù)后機(jī)體免疫狀況下降，可能是因為異體輸血導(dǎo)致機(jī)體免疫力受到抑制。蘭炯采等［9］研究發(fā)現(xiàn)可溶性HLA-類抗原分子和Fas配體存在于同種異體血的血清中，它們可以結(jié)合相應(yīng)的配體，通過封閉受體和誘導(dǎo)凋亡來抑制T細(xì)胞功能。

IL-2具有活化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，激活巨噬細(xì)胞的功能；IFN-γ可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，它們活性的增高有利于抑制和排除細(xì)菌，增強(qiáng)患者術(shù)后抗感染能力及傷口愈合能力。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第1天，觀察組IL-2和IFN-γ顯著增高，在術(shù)后第7天恢復(fù)至正常水平，表明自體輸血對機(jī)體免疫抑制影響不明顯。異體血的淋巴細(xì)胞可以在受血者體內(nèi)長期存活，使Th2型淋巴細(xì)胞分泌IL-10增多，抑制Th1型細(xì)胞分化發(fā)育，IL-2、IFN-γ分泌減少［11］。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第1天對照組IL-10顯著上升，但是觀察組患者未見明顯上升；術(shù)后第7天，對照組IL-10仍然顯著高于術(shù)前，而IL-2、IFN-γ顯著低于術(shù)前，可能是因為異體輸血下調(diào)被輸血者的免疫反應(yīng)，造成免疫失衡，免疫反應(yīng)由細(xì)胞免疫向體液免疫偏離，被輸血者抵抗感染能力下降。

圖1 1例惡性腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞及CD4＋、CD8＋亞群分析雙參數(shù)散點圖

表3 2組患者圍手術(shù)期細(xì)胞因子的變化 （±s）

表3 2組患者圍手術(shù)期細(xì)胞因子的變化 （±s）

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綜上所述，腫瘤患者圍手術(shù)期可采用自體和異體兩種輸血方法，這兩種方法對T淋巴細(xì)胞及不同亞群數(shù)量及功能變化具有不同的影響，自體輸血對惡性腫瘤患者免疫功能影響較小，異體輸血明顯抑制患者免疫功能。