張 杰，趙 昂，鮑曉文，張銘雅，馬 博

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

雷公藤甲素被認(rèn)為是雷公藤的主要活性成分，生物活性廣泛，具有抗炎、免疫抑制、抗囊腫和抗腫瘤等作用[1]。但是，雷公藤甲素對(duì)機(jī)體的毒性嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，例如可能會(huì)導(dǎo)致男性不育、白血球減少癥、月經(jīng)紊亂，易導(dǎo)致腎毒性和肝毒性[2-3]。其中，雷公藤甲素所造成的生殖功能障礙是最為高發(fā)的毒性反應(yīng)之一。因此，雷公藤甲素常被用來(lái)作為模型藥物誘發(fā)雄性動(dòng)物的不育模型，其潛在機(jī)制可能是雷公藤甲素所導(dǎo)致的睪丸內(nèi)抗氧化系統(tǒng)損傷，從而造成氧化與抗氧化失衡，使睪丸內(nèi)部產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，繼而引起睪丸細(xì)胞凋亡[4-5]。

紫云英苷又名黃芪苷、百蕊草素II，山奈酚-3-O-葡萄糖苷，廣泛存在于菟絲子、百蕊草和杜仲等植物中，是主要的活性成分之一，研究表明：紫云英苷具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等[6-7]。紫云英苷具有緩解遠(yuǎn)志皂苷引起的溶血作用和抗CCl4肝毒的作用，同時(shí)可以提高小鼠體內(nèi)超氧歧化酶(SOD)活性，降低小鼠肝內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(MDA)的含量以及增加機(jī)體抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的含量[8]。

中藥菟絲子和杜仲被長(zhǎng)期用于治療男性生殖系統(tǒng)疾病,紫云英苷作為其中的主要活性成分卻鮮有相關(guān)的報(bào)道。因此，本研究采用雷公藤甲素導(dǎo)致小鼠睪丸睪丸損傷模型，研究被雷公藤甲素?fù)p傷后，紫云英苷對(duì)睪丸指數(shù)、睪丸組織學(xué)、氧化應(yīng)激水平的改善，以評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠睪丸睪丸損傷的治療作用。并通過(guò)原位末端缺刻標(biāo)記法(TUNEL)法研究睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡情況及免疫印跡法(Western blotting法)和免疫組化技術(shù)檢測(cè)磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)的表達(dá)，以探討紫云英苷改善雷公藤甲素導(dǎo)致的睪丸損傷的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為治療男性生殖系統(tǒng)疾病的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雷公藤甲素(純度≥98%)、紫云英苷(純度≥98%)，上海源葉生物公司；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；SOD測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司；一抗p-JNK、β-actin以及二抗，美國(guó)丹弗斯Cell Signaling Technology (CST)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模與分組

昆明種雄性小鼠60只,體質(zhì)量(25±2)g,將小鼠隨機(jī)分成3組,每組20只,即正常對(duì)照組、雷公藤甲素模型組和紫云英苷組。

各組的具體給藥方式如下(給藥標(biāo)準(zhǔn)按每10 g小鼠體質(zhì)量計(jì)。)。正常對(duì)照組：口服灌胃生理鹽水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射生理鹽水(0.1 mL)；模型組：口服灌胃生理鹽水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，給藥體積為0.1 mL)；紫云英苷組：口服灌胃紫云英苷(15、30和60 mg/kg，給藥體積為0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，給藥體積為0.1 mL)。按以上方法給藥14 d。

1.2.2 睪丸指數(shù)

小鼠處死后，立即取出雙側(cè)附睪及雙側(cè)睪丸，剝離連黏的脂肪組織，迅速稱(chēng)質(zhì)量并記錄濕質(zhì)量，按式(1)計(jì)算睪丸指數(shù)。

睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)

(1)

1.2.3 睪丸組織的形態(tài)學(xué)觀察

取睪丸放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%甲醛固定液中，沿其長(zhǎng)軸垂直于生精小管走向剖開(kāi)，經(jīng)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色，置光鏡下觀察。

1.2.4 睪丸組織SOD活性和MDA含量的測(cè)定

取小鼠睪丸低溫勻漿后離心取上清，根據(jù)1.1項(xiàng)中的試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定SOD活性和MDA含量。取等量小鼠睪丸低溫勻漿后提取總蛋白，并用二辛可寧酸(BCA)法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。利用睪丸的蛋白濃度對(duì)相對(duì)應(yīng)的睪丸內(nèi)的SOD活性與MDA含量進(jìn)行校正。

1.2.5 睪丸TUNEL染色

小鼠睪丸石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加20 μL不含DNase的蛋白酶K室溫孵育30 min，后加入體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液孵育10 min以滅活內(nèi)源性酶，隨后滴加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液，37 ℃孵育60 min。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，脫水、透明后用含抗淬滅劑的封片劑封片，再在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 睪丸免疫組織化學(xué)檢測(cè)睪丸組織中JNK(p-JNK)的表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)10 min; 滴加p-JNK一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS 緩沖液漂洗2 min,3 次后加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液漂洗2 min，3次后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC),37 ℃ 孵育20 min。隨后使用氧化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色并用蘇木素輕度復(fù)染，最后以中性樹(shù)膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照后用Image pro plus 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.7 Western blotting法測(cè)定p-JNK在睪丸組織中的蛋白表達(dá)

取一定量的睪丸組織，PBS 液清洗3 次，加入蛋白裂解液后勻漿，冰上孵育30 min；4 ℃離心10 min，12 000 r/min 高速離心；吸取上清液即為蛋白液。利用甲酸(BCA)法測(cè)定提取蛋白的濃度，制備蛋白樣品。恒壓模式下行SDS-PAGE 凝膠電泳，恒流濕式電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育兔抗p-JNK抗體和內(nèi)參β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜。滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，在 ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)中采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ECL法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè),并用 Image LabTM software 對(duì)條帶進(jìn)行光密度定性分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD) 表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊后的各組采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較用最小顯著性差異法(least-significant difference,LSD)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫云英苷對(duì)睪丸指數(shù)的影響

取各組小鼠雙側(cè)睪丸并稱(chēng)質(zhì)量，考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素?fù)p傷的小鼠睪丸的質(zhì)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：雷公藤甲素模型組睪丸指數(shù)相對(duì)于正常組有顯著下降(P<0.01)，說(shuō)明在雷公藤甲素的毒性作用下，小鼠睪丸發(fā)生了明顯的病變性萎縮；低劑量(15 mg/kg)紫云英苷即展現(xiàn)出明顯的抗雷公藤甲素對(duì)睪丸的毒性作用，其顯著增加了小鼠睪丸的質(zhì)量，提高了小鼠睪丸指數(shù)(P<0.05)；中高劑量(20 mg/kg)紫云英苷對(duì)睪丸的保護(hù)作用更加顯著，小鼠睪丸質(zhì)量指數(shù)極顯著改善(P<0.05)，并趨近于正常，且保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

圖1 紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠睪丸指數(shù)的影響Fig.1 Effects of astragalin on triptolide-induced mice testis index

2.2 紫云英苷對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

通過(guò)小鼠睪丸HE染色病理分析，考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素造成的小鼠睪丸損傷的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)可知，正常對(duì)照組小鼠睪丸生精上皮厚，細(xì)胞層次寬，曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則，基底面至腔面可見(jiàn)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞等各個(gè)發(fā)育階段細(xì)胞，腔內(nèi)可見(jiàn)成熟精子，間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育良好。由圖2(b)可知，在雷公藤甲素的毒性作用下，模型組曲細(xì)精管萎縮變形或扭曲成不規(guī)則形狀，生精細(xì)胞數(shù)量及管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組。模型組睪丸組織形態(tài)學(xué)的顯著病變充分說(shuō)明了雷公藤甲素對(duì)雄性動(dòng)物的生殖毒性。由圖2(c)可知，在低劑量紫云英苷保護(hù)作用下，小鼠曲細(xì)精管有不同程度的萎縮變形，生精細(xì)胞數(shù)量及管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組，但多于模型組。說(shuō)明低劑量紫云英苷抗雷公藤甲素生殖毒性的作用已有所體現(xiàn)。由圖2(d)可知，中劑量紫云英苷保護(hù)組小鼠睪丸曲細(xì)精管的變形程度與模型組相比已有明顯改善，部分管腔內(nèi)可見(jiàn)絲狀精子細(xì)胞各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則。說(shuō)明中劑量紫云英苷已可以保護(hù)小鼠睪丸的組織形態(tài)，并逐漸恢復(fù)雷公藤甲素造成的小鼠生精功能障礙。由圖2(e)可知，高劑量紫云英苷治療組小鼠的睪丸曲細(xì)精管較為完整，生精細(xì)胞排列有序，層次清楚，間質(zhì)趨近于正常，精細(xì)胞及管腔內(nèi)精子細(xì)胞數(shù)量基本正常。說(shuō)明高劑量的紫云英苷展現(xiàn)出良好的逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素所造成的生殖毒性作用，使小鼠的睪丸趨近于正常狀態(tài)，并已恢復(fù)其生理功能。

圖2 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素導(dǎo)致的睪丸組織形態(tài)損傷的保護(hù)Fig.2 Protection of astragalin against triptolide-induced damage of testicular tissue morphology

2.3 紫云英苷對(duì)睪丸氧化應(yīng)激水平的影響

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌睪酮的重要器官，其富含線粒體及黃嘌呤氧化酶等生成活性氧自由基的酶類(lèi)，且具有多量不飽和脂肪酸，使睪丸組織對(duì)于氧化應(yīng)激損傷更加敏感[9]。因此，抑制雷公藤甲素對(duì)睪丸的氧化應(yīng)激損傷成為了減弱雷公藤甲素雄性生殖毒性的重要策略之一。

圖3 紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的MDA 和SOD活性的影響Fig.3 Effects of astragalin on of the level MDA and the activity superoxide dismutase SOD induced by triptolide in mice testis

MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化最重要的標(biāo)志產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷。因此可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的水平，反映機(jī)體組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，并間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠歧化O2-形成H2O2，消除超氧陰離子毒性。因此，筆者通過(guò)檢測(cè)睪丸內(nèi)MDA含量及SOD活性，考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：與正常對(duì)照組相比，雷公藤甲素模型組睪丸內(nèi)的SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，睪丸內(nèi)的過(guò)氧化環(huán)境可能成為小鼠睪丸受損的原因之一。而不同劑量的紫云英苷保護(hù)組小鼠睪丸內(nèi)SOD活性較模型組明顯升高(P<0.05)，MDA含量顯著下降(P<0.05)。隨著紫云英苷劑量的提高，小鼠睪丸內(nèi)的過(guò)氧化狀態(tài)不斷趨于正常的平衡態(tài)，即SOD活性的提高和MDA含量的下降與紫云英苷劑量之間呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性關(guān)系。說(shuō)明紫云英苷良好的抗氧化作用可以對(duì)抗雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)過(guò)氧化，恢復(fù)小鼠睪丸內(nèi)氧化-抗氧化平衡。

2.4 紫云英苷對(duì)睪丸細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生超過(guò)抗氧化能力，組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，將引起蛋白質(zhì)表達(dá)異常，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡[10]。通過(guò)TUNEL染色法，考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，TUNEL染色結(jié)果中，正常對(duì)照組中只可見(jiàn)極少的睪丸間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞發(fā)生凋亡，雷公藤甲素模型組的凋亡率顯著高于正常對(duì)照組。紫云英苷對(duì)雷公藤甲素造成的睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞的凋亡則有明顯的抑制作用，且抑制作用具有劑量依賴(lài)性。

2.5 紫云英苷對(duì)睪丸p-JNK表達(dá)的影響

Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)：雷公藤甲素在體內(nèi)外均可破壞睪丸支持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，促使活性氧簇(ROS)水平提高，從而激活JNK通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過(guò)免疫組化考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的睪丸內(nèi)p-JNK表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。其中p-JNK免疫組化染色著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜可見(jiàn)棕黃色顆粒，細(xì)胞無(wú)色或淡黃色為陰性。由圖5可知：與正常對(duì)照組相比，雷公藤甲素使模型組小鼠睪丸內(nèi)p-JNK表達(dá)量顯著上升(P<0.01)；經(jīng)低劑量紫云英苷治療后，小鼠睪丸內(nèi)棕黃色顆粒相較于模型組顯著減少，即p-JNK表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；中劑量紫云英苷治療后，小鼠睪丸內(nèi)p-JNK表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.01)，且和低劑量組相比也有較大下降；高劑量紫云英苷的保護(hù)作用明顯逆轉(zhuǎn)了雷公藤甲素對(duì)睪丸內(nèi)p-JNK的上調(diào)作用，p-JNK的陽(yáng)性表達(dá)同樣顯著低于模型組(P<0.01)，使小鼠睪丸組織內(nèi)p-JNK的表達(dá)量趨于正常。

圖4 紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of astragalin on triptolide-induced apoptosis in testicular cells

圖5 免疫組化法紫云英苷對(duì)雷公藤誘導(dǎo)的睪丸p-JNK表達(dá)的影響Fig.5 The protein expression of p-JNK in triptolide-induced mice testis detected by immunohistochemistry

同時(shí)，結(jié)合Western blotting法考察紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的睪丸內(nèi)p-JNK蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，相較于正常組，模型組中雷公藤甲素可使活化的p-JNK蛋白表達(dá)量大量提高(P<0.01)。紫云英苷的治療作用體現(xiàn)在其可以抑制p-JNK的表達(dá)，即在低劑量的情況下，小鼠睪丸p-JNK表達(dá)量便與模型組形成顯著性差異(P<0.05)；并隨著給藥劑量的上升，中、高劑量組小鼠睪丸的p-JNK表達(dá)與模型組相比形成極顯著性差異(P<0.01)。其結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，提示紫云英苷對(duì)雷公藤甲素造成的睪丸細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其抑制p-JNK的表達(dá)有關(guān)。

圖6 免疫印跡法檢測(cè)紫云英苷對(duì)雷公藤甲素誘導(dǎo)的 睪丸p-JNK表達(dá)的影響Fig.6 The protein expression of p-JNK in triptolide-induced mice testis detected by Western blotting

3 結(jié)論

本研究中，紫云英苷可以有效地逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素造成的小鼠睪丸指數(shù)下降，修復(fù)睪丸組織形態(tài)的損傷，對(duì)小鼠睪丸結(jié)構(gòu)和功能起到了良好的保護(hù)作用。其保護(hù)作用的具體機(jī)制可能與紫云英苷可以抑制雷公藤甲素引起的小鼠睪丸內(nèi)的氧化還原失衡，進(jìn)而抑制p-JNK的表達(dá)，從而減少睪丸細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，本研究為探討紫云英苷作為睪丸氧化應(yīng)激損傷潛在的預(yù)防和治療藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。