孫定軍，邢波，陳漠水，馬添翼，張福偉

動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎，心血管疾病是人類死亡的主要原因。動脈壁中膽固醇積聚是動脈粥樣硬化的特征，其中巨噬細胞起決定性作用[1-2]。巨噬細胞形成的泡沫細胞在脂質積累中起著至關重要的作用。ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)可促進膽固醇流出至無脂質載脂蛋白A1并增加高密度脂蛋白(HDL)的形成，是預防動脈粥樣硬化的重要靶點[3-4]。ABCA1基因在巨噬細胞中的表達受配體依賴性核受體的轉導調節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)通過誘導肝臟X受體α(liver X receptor α，LXRα)基因和ABCA1基因的轉錄來增強膽汁外流[5-7]。LXRα與類視黃醇X受體結合形成異二聚體，并跟蹤ABCA1啟動子中特定DNA反應元件的連接，刺激ABCA1基因轉錄，增加ABCA1依賴性膽固醇外流至ApoA1。因此，PPARγ/LXRα/ABCA1信號可刺激巨噬細胞膽固醇外流[8]。瑞舒伐他汀是一種選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑。HMG-CoA還原酶抑制劑是轉變3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A為甲戊酸鹽—膽固醇前體的限速酶。瑞舒伐他汀的主要作用部位是肝，是降低膽固醇的靶向器官[9]。瑞舒伐他汀增加了肝LDL細胞表面受體數目，促進LDL的吸收和分解代謝，抑制了VLDL的肝合成，由此降低VLDL和LDL微粒的總數[10]。本研究擬探討瑞舒伐他汀經PPARγ-LXRα信號通路抑制THP-1巨噬細胞脂質蓄積的機制，為動脈粥樣硬化的治療提供理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)THP-1巨噬細胞：購自中國科學院細胞庫；(2)試藥試劑：瑞舒伐他汀(美國sigma公司)、NaHCO3、青霉素、鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基(賽默飛世公司)，10%熱滅活的胎牛血清(FBS，sigma公司)、氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)(碧云天生物科技公司)、MTT(碧云天生物科技公司)、十二烷基硫酸鈉(賽默飛世公司)、膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)試劑(BD Pharmingen公司)、MMLV逆轉錄酶(Gibco/BRL公司)、6%SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠(Millipore Corporation，USA)、PVDF(Millipore Corporation，USA公司)、PPARγ-LXRα一抗(均為1∶1 000，美國賽默飛世公司)，總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)試劑盒為貝克曼原廠試劑、RNAzol試劑盒(sigma公司)；(3)儀器設備：UK-098CO2培養(yǎng)箱(美國熱電)、VT-098酶標儀(美國BioTek Instruments)、FC500流式細胞儀(Beckman Coulter)、貝克曼AU-480生化儀、Light Cycler Run 5.32實時PCR系統(tǒng)(美國Roche)。

1.2 THP-1巨噬細胞培養(yǎng)及分組 2018年12月—2019年3月于?？谑腥嗣襻t(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院中心實驗室進行實驗，將THP-1巨噬細胞在含有10%FBS、0.37%NaHCO3、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基置于5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。每2 d更換一次培養(yǎng)基。對照組：取THP-1巨噬細胞液(細胞濃度為5×106/ml)10 ml于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20% O2)；ox-LDL組：取THP-1巨噬細胞液(細胞濃度為5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加入ox-LDL，使其終濃度為100 mmol/L，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20% O2)；瑞舒伐他汀低、中、高劑量組：取THP-1巨噬細胞液(細胞濃度為5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，加入ox-LDL，使其終濃度為100 mmol/L，各組分別加入瑞舒伐他汀，使瑞舒伐他汀最終濃度為10.0 μg/ml、100.0 μg/ml、1 000.0 μg/ml，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2%O2、93%N2)。以上各組每孔設6個復孔，培養(yǎng)72 h。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 THP-1巨噬細胞活力測定：細胞培養(yǎng)結束后，向每個孔中加入MTT(0.5 mg/ml)溶液100 μl， 然后將96孔板在37℃、5%CO2、飽和濕度下溫育，加入20%十二烷基硫酸鈉(含有50%二甲基甲酰胺)100 μl以溶解甲晶體，在酶標儀570 nm波長下測量光密度值(OD值)。

1.3.2 THP-1巨噬細胞凋亡水平測定：使用FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)雙重染色，通過流式細胞術測定細胞凋亡。與番茄紅素一起溫育后，將細胞在PBS中洗滌2次，通過胰蛋白酶消化收獲，懸浮于PBS液3 ml中，并以3000×g離心5 min。除去上清液后，將細胞在含有膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI的結合緩沖液中室溫溫育15 min。 使用流式細胞儀進行熒光分析。

1.3.3 THP-1巨噬細胞TC、FC、CE水平測定：應用貝克曼AU-480型生化儀測定細胞上清液TC、FC和CE的水平。

1.3.4 THP-1巨噬細胞PPARγ-LXRα基因水平測定：通過RNAzol試劑盒從細胞培養(yǎng)物中分離總細胞RNA，并使用oligo(dT)作為引物逆轉錄成cDNA(MMLV逆轉錄酶，Gibco/BRL，698547)，然后用PPARγ、LXRα、ABCA1，ApoA1和β-肌動蛋白上的10個引物堿基擴增。用于擴增PPARγcDNA的引物是位于5'-非翻譯區(qū)的5'-TCTCCAGCATTTCTACTCCAC-3'和位于3'-非翻譯區(qū)的5'-GCCAACAGCTTCTCCTTCTCG-3'，用于擴增LXRαcDNA的引物是5'-TCAGCCGGGAGGACCAGATTG-3'和5'-CCGGAGGCTCACCAGTTTCATTAG-3'，用于擴增β-肌動蛋白的引物是5'-GAGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'和5'-GCCTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'。使用Light Cycler Run 5.32實時PCR系統(tǒng)進行定量PCR，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s(35個循環(huán))，然后在72℃持續(xù)7 min。PPARγ、LXRα和β-肌動蛋白擴增產物大小分別為460、404、439、215和518 bp。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色。通過Matrox Inspector 2.1軟件定量PPARγ、LXRα相對水平。

1.3.5 THP-1巨噬細胞PPARγ-LXRα蛋白水平測定：從THP-1巨噬細胞中提取總蛋白質，并與上樣緩沖液混合,使用6%SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠，在每個泳道(20 μg)中加載等量蛋白質電泳120 min(80 V、30 min和120 V、90 min)。將相關蛋白質在200 mA下轉移至PVDF膜2 h，然后用5%脫脂奶粉封閉并與PPARγ-LXRα抗體一起在4℃溫度下孵育過夜;然后將膜用PBS洗滌3次(每次10 min)，然后與HRP綴合的第二抗體一起溫育2 h。用BeyoECL Plus(Beyotime)和Tanon 5500觀察Western印跡條帶。

2 結 果

2.1 各組THP-1巨噬細胞的OD值、存活率比較 與對照組比較，ox-LDL組OD值、存活率均明顯升高(P<0.05)，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組OD值、存活率明顯降低(P均<0.05)，且隨著瑞舒伐他汀劑量的增加，各組OD值、存活率逐漸降低(P均<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組THP-1巨噬細胞OD值、存活率比較

圖1 各組THP-1巨噬細胞增殖情況(甲基紫染色,×200)

2.2 各組THP-1巨噬細胞凋亡率比較 與對照組THP-1巨噬細胞凋亡率(12.2±0.19)%比較，ox-LDL組(1.13±0.24)%降低(t/P=12.547/0.000)，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀低(3.38±0.20)%、中(7.11±0.21)%、高(7.69±0.18)%劑量組凋亡率水平依次升高(F/P=19.632/0.000)，見圖2。

2.3 各組THP-1巨噬細胞TC、FC、CE水平比較 與對照組比較， ox-LDL組TC、FC、CE水平明顯升高(P均<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加TC、FC、CE水平逐漸降低(P<0.05)，見表2。

2.4 各組THP-1巨噬細胞PPARγ、LXRα mRNA表達水平比較 與對照組比較， ox-LDL組PPARγ、LXRα mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加PPARγ、LXRα mRNA水平逐漸升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組THP-1巨噬細胞PPARγ、LXRα mRNA表達水平比較

2.5 各組THP-1巨噬細胞 PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較 與對照組比較， ox-LDL組PPARγ、LXRα 蛋白表達水平均降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組隨著瑞舒伐他汀劑量的增加PPARγ、LXRα蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。見表4、圖3。

圖2 各組THP-1巨噬細胞凋亡情況

表2 各組THP-1巨噬細胞TC、FC、CE水平比較

組 別復孔數TCFCCE對照組6158.63±15.63120.36±19.63153.63±19.52ox-LDL組6569.63±17.25561.69±20.36526.25±18.25瑞舒伐他汀低劑量組6445.63±14.58469.32±16.58419.52±21.63瑞舒伐他汀中劑量組6334.63±13.98321.69±19.63352.36±18.63瑞舒伐他汀高劑量組6221.63±14.42186.36±18.54296.59±19.63 F值121.321259.658368.487 P值0.0000.0000.000

表4 各組THP-1 巨噬細胞PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較

圖3各組THP-1巨噬細胞PPARγ、LXRα蛋白表達水平比較

3 討 論

本研究結果顯示，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組OD值、存活率、TC、FC、CE水平均明顯降低，凋亡率明顯升高，提示瑞舒伐他汀能抑制THP-1巨噬細胞增殖，促進THP-1巨噬細胞凋亡，促進THP-1巨噬細胞膽固醇流出抑制泡沫細胞的形成。瑞舒伐他汀在多種疾病中具有多種生物學功能，如心血管疾病和糖尿病腎病，其具有預防脂質積聚，降低血壓，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。研究表明，瑞舒伐他汀通過降低TC、LDL-C、TG和增加HDL-C的水平起到抗動脈粥樣硬化作用[11]。瑞舒伐他汀可抑制巨噬細胞活化和泡沫細胞形成，還可以保護HUVEC免于細胞凋亡，并提示通過保護免受H2O2介導的氧化應激機制進行保護[12-14]。此外，瑞舒伐他汀降低膽固醇水平并抑制由脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞因子產生，并改變喂食高脂肪酸飲食的小鼠或大鼠中脂肪酸的組成[15-17]。瑞舒伐他汀可通過延遲LDL氧化保護血管內皮細胞，通過抑制血小板聚集防止血液凝固，增加HDL-C并降低TC、TG和LDL水平。動物實驗還顯示，瑞舒伐他汀可降低LDLR -/-和ApoE -/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積，并顯著降低小鼠膽固醇水平，然而，所涉及的分子機制尚不清楚[18-19]。隨后的研究表明，瑞舒伐他汀可以調節(jié)NF-κB信號通路，并抑制白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達。炎性反應和膽固醇代謝紊亂被認為是引起動脈粥樣硬化的主要危險因素，而瑞舒伐他汀可潛在地用作抗動脈粥樣硬化。

PPARγ/LXRα途徑是調節(jié)ABCA1表達的核心機制，該途徑對ABCA1表達的影響已被廣泛接受。LXRα作為核轉錄因子，可以調節(jié)膽固醇轉運途徑中的多個基因，例如ABCA1和ABCG1的轉錄調節(jié)[20]。另一項研究表明，LXRα興奮劑T0901317可抑制小鼠動脈粥樣硬化的進展。細胞實驗證實，T0901317通過激活巨噬細胞中的LXRα上調ABCA1和ABCG1的表達，從而驅使細胞內的膽固醇流向ApoA1和HDL并抑制泡沫細胞的形成。另一項研究表明，LXRα表達受其他核轉錄因子調節(jié)，如PPAR。 PPAR是一種核轉錄因子，具有3種亞型：PPARα、PPARβ和PPARγ[21]。這些核轉錄因子與其配體組合可改變空間構象，隨后與靶基因啟動子內的PPAR反應元件結合以調節(jié)靶基因的轉錄[22]。這些核轉錄因子也可以激活LXRα并與AX受體結合形成異二聚體，其調節(jié)靶基因的轉錄。在3種PPAR亞型中，PPARγ可調節(jié)葡萄糖和脂質代謝，以及炎性反應和免疫作用[23]。因此，這些轉錄因子是細胞分化和脂質代謝轉錄調節(jié)的關鍵。本研究結果顯示，與ox-LDL組比較，瑞舒伐他汀各劑量組PPARγ、LXRα mRNA和蛋白表達明顯升高，這與上述討論一致，同時提示，瑞舒伐他汀促進PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表達，進而介導PPARγ/LXRα途徑，促進膽固醇流出，并減少THP-1泡沫細胞中的脂質積累。已經證實PPARγ上調LXRα表達。研究表明，瑞舒伐他汀在高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中表達PPARγ，并且還激活腺苷5'-一磷酸(AMP)介導的蛋白激酶(AMPK)信號通路。這些研究也與本結果一致。

綜上所述，瑞舒伐他汀能促進THP-1巨噬細胞膽固醇流出，減少THP-1泡沫細胞中的脂質積累；其機制與瑞舒伐他汀促進PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表達，進而激活PPARγ/LXRα途徑有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

孫定軍：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫及修改；邢波、陳漠水：參與實驗過程并進行數據分析，論文審核；馬添翼：細胞培養(yǎng)及相關實驗；張福偉：細胞培養(yǎng)及相關實驗檢查。