李建勛， 王玉珍， 盧 嘉， 徐 迪， 單吉浩， 范 蓓

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 北京 100193)

金銀花(Lonicerajaponica)又名忍冬花，是忍冬科多年生植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]，藥食兩用，為常用大宗中藥材。金銀花中主要化學(xué)成分有色素、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類等和微量元素，其性寒、味甘，具有清熱解毒、消炎去腫等功效[2]，常用于溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)治療肺癆也有顯著效果[3-4]。此外，金銀花作為一種茶飲料頗受消費(fèi)者喜愛(ài)，除了可以直接泡茶飲用之外，還開(kāi)發(fā)出多種茶飲品，如王老吉、和其正等。

金銀花在種植過(guò)程中經(jīng)常遭受病蟲(chóng)害導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，茶農(nóng)會(huì)通過(guò)噴灑大量農(nóng)藥治理病蟲(chóng)害[5-7]。有機(jī)磷農(nóng)藥具有殺蟲(chóng)效率高、范圍廣、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，其消費(fèi)量居各類農(nóng)藥首位，其中對(duì)硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷等有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花種植過(guò)程中使用較為頻繁，殘留現(xiàn)象常常發(fā)生[8-9]。顧炎等[10]通過(guò)對(duì)市售金銀花樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，60份金銀花樣品中有23份樣品檢出有機(jī)磷農(nóng)藥，超標(biāo)農(nóng)藥達(dá)11種；鄭雙雙等[11]發(fā)現(xiàn)金銀花樣品受到有機(jī)磷農(nóng)藥污染嚴(yán)重，不合格率達(dá)60%，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為影響金銀花質(zhì)量安全的嚴(yán)重問(wèn)題之一。目前，人們已養(yǎng)成用開(kāi)水沖泡金銀花直接飲用茶湯的習(xí)慣，而金銀花中殘留的農(nóng)藥會(huì)通過(guò)沖泡遷移入茶湯中而被人體直接吸收，Cao等[12]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥在茶葉沖泡過(guò)程中的遷移率從0.7%(毒死蜱)到90.1%(甲胺磷)不等。不同有機(jī)磷農(nóng)藥因具有不同的理化性質(zhì)，沖泡過(guò)程中具有不同的遷移能力，從而對(duì)人體健康的影響也不盡相同。因此確定農(nóng)藥從金銀花到茶湯中的遷移率并建立遷移預(yù)測(cè)模型具有重要意義。

研究通過(guò)QuEChERS-GC-MS/MS快速測(cè)定金銀花和茶湯中6種有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷)殘留，優(yōu)化了凈化劑填料組合，并深入研究金銀花在沖泡過(guò)程中農(nóng)藥的遷移規(guī)律，建立遷移預(yù)測(cè)模型，旨在為我國(guó)制定金銀花中有機(jī)磷農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷)標(biāo)準(zhǔn)品，天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯，均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、多壁碳納米管(MWCNTs)(ID:5～10 nm, OD:10～20 nm, Length: 10～30 μm)，北京華威銳科化工有限公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂，均為分析純，北京鵬彩精細(xì)化工有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli- Q型凈化系統(tǒng)過(guò)濾的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A- 7000C型氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；LYNX6000型高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；PX2242H型精密天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；Vortex- Genie 2型渦旋混合器，美國(guó)Scientific公司；3K15型離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；Milli- Q型純水儀，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用儲(chǔ)備液配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，均于-18 ℃冰箱保存待用。用空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋成 1 000、500、200、100、50、10、5、1 μg/L 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2金銀花污染樣品制備

采用室內(nèi)制備污染金銀花樣品的方式，取新購(gòu)置的金銀花樣品500 g，均勻平鋪，用噴壺將10 mL質(zhì)量濃度為2 μg/mL的6種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均勻地噴灑在金銀花表面，靜置20 min晾干后，將樣品粉碎，置于密封袋混勻，于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.3.3金銀花茶湯制備

取3.0 g制備好的金銀花放入250 mL燒杯中，加入150 mL沸水浸泡10 min，過(guò)濾后冷卻，得到第一批茶湯樣品。然后重復(fù)沖泡2次，分別獲得第二批和第三批茶湯樣品，使用3批茶湯的農(nóng)藥殘留量之和計(jì)算農(nóng)藥遷移率(transfer rate，TR)。

1.3.4樣品前處理

金銀花樣品前處理：參照林濤等[13]方法，準(zhǔn)確稱取(2.0±0.1)g金銀花于50 mL離心管中，加入10 mL水和10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min后，加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋振蕩1 min，于5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液于含有10 mg MWCNTs、15 mg PSA、150 mg 無(wú)水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，于12 000 r/min離心1 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)GC-MS/MS分析。

茶湯樣品前處理：準(zhǔn)確量取10 mL沖泡制得的茶湯樣品直接加入10 mL乙酸乙酯進(jìn)行提取，其余步驟同金銀花提取步驟。

1.3.5儀器條件設(shè)定

色譜條件：Rxi-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，最后以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min。載氣：氦氣，流速1.0 mL/min。進(jìn)樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；每種目標(biāo)物選擇豐度較高的2個(gè)碎片離子分別作為定量和定性離子，并優(yōu)化每個(gè)目標(biāo)物的最佳碰撞能(CE)，以獲得檢測(cè)的最佳靈敏度。6種有機(jī)磷農(nóng)藥的理化性質(zhì)(水溶解度(Ws)和正辛醇- 水分配系數(shù)(Kow))及具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種有機(jī)磷農(nóng)藥的理化性質(zhì)和質(zhì)譜參數(shù)

*為定量離子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0以及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，Origin 8.6軟件進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化劑填料配比選擇

金銀花基質(zhì)復(fù)雜，含有色素、生物堿、有機(jī)酸等有機(jī)成分[14-18]，大大增加了對(duì)目標(biāo)物提取凈化和分析檢測(cè)的難度。PSA能夠清除金銀花中的極性親脂性色素、脂肪酸和糖類等極性成分，而MWCNTs比表面積大，具有中空結(jié)構(gòu)，故吸附性能優(yōu)良，目前廣泛應(yīng)用于各類食品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)[19-21]。

實(shí)驗(yàn)參照Wang等[22]的實(shí)驗(yàn)方案并做出一定的改進(jìn)。使用的凈化填料種類為無(wú)水硫酸鎂、PSA、MWCNTs，對(duì)3種填料的4種不同配比進(jìn)行優(yōu)化，具體方案為：(1)10 mg MWCNTs、15 mg PSA、150 mg無(wú)水硫酸鎂；(2)20 mg MWCNTs、30 mg PSA、150 mg無(wú)水硫酸鎂;(3)50 mg MWCNTs、150 mg無(wú)水硫酸鎂；(4)30 mg MWCNTs、45 mg PSA、150 mg無(wú)水硫酸鎂。盡可能使填料更多地吸附有機(jī)雜質(zhì)而將待檢測(cè)的目標(biāo)化合物保留在提取液中，每組進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1。采用方案(3)或(4)時(shí)，倍硫磷和丙溴磷的回收效果均明顯低于方案(1)和(2)，且精密度較差；采用方案(1)或(2)時(shí)，6種有機(jī)磷農(nóng)藥回收率均≥85%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤4.96%，回收率和精密度均令人滿意；綜合比較方案(1)和方案(2)，秉承節(jié)約資源、降低成本的理念，填料方案(1)為較佳選擇。

圖1 不同凈化劑組合下6種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率Fig.1 Recoveries of 6 organophosphorus pesticides under different combinations of purification fillers

2.2 驗(yàn)證結(jié)果分析

2.2.1線性范圍與定量限分析

每種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中受到的基質(zhì)效應(yīng)根據(jù)其在各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)比值來(lái)計(jì)算，添加質(zhì)量濃度為50 μg/L，結(jié)果見(jiàn)表2。不同有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中受到了不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此需要采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。配制 1、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/kg的金銀花基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和1、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/L的茶湯基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以信噪比(S/N=10)為定量限，按1.3.5中的質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花與茶湯中的線性范圍與定量限見(jiàn)表2。由表2可知，在金銀花和茶湯中，倍硫磷、特丁硫磷、丙溴磷、治螟磷和滅線磷分別在1～1 000 μg/kg和1～1 000 μg/L均具有良好的線性關(guān)系，R2>0.991；在茶湯中，對(duì)硫磷在10～1 000 μg/L呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，這是由于對(duì)硫磷在茶湯中定量限較高，為10 μg/L；而其他農(nóng)藥在茶湯中定量限均為1 μg/L。說(shuō)明該方法具有較高的靈敏度。

2.2.2準(zhǔn)確度和精密度分析

按照QuEChERS方法對(duì)金銀花和茶湯進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，金銀花選取1、10、50、100 μg/kg四個(gè)水平，而茶湯選取1、8、40、80 μg/L四個(gè)水平，分別以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度，每組平行實(shí)驗(yàn)6次，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，6種有機(jī)磷農(nóng)藥在4個(gè)添加水平的回收率介于65.6%～110.3%，且RSD≤18.26%，方法準(zhǔn)確度和精密度良好，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物檢測(cè)。圖2為金銀花和茶湯中6種有機(jī)磷農(nóng)藥的MRM色譜，其中金銀花中農(nóng)藥添加水平為10 μg/kg，茶湯中添加水平為8 μg/L。

表2 6種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中的線性方程和基質(zhì)效應(yīng)

表3 6種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花與茶湯中的回收率

2.3 金銀花浸泡過(guò)程農(nóng)藥遷移模型分析

2.3.1農(nóng)藥遷移率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用了人們?nèi)粘ｏ嫴璩Ｓ玫臎_泡方式，以1.3.3節(jié)方法研究6種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花沖泡過(guò)程中的遷移規(guī)律。為消除制備污染樣品時(shí)農(nóng)藥分布不均勻的情況，在噴灑后粉碎混勻。由于農(nóng)藥會(huì)揮發(fā)，因此需在沖泡實(shí)驗(yàn)前測(cè)定其原始含量，平行實(shí)驗(yàn)6次。6種農(nóng)藥對(duì)硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷在沖泡過(guò)程前的原始含量分別為95.94、70.34、64.53、129.11、70.34、162.11 μg/kg，沖泡3次的遷移率結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，在第一、二、三批沖泡過(guò)程中，6種農(nóng)藥的遷移率分別介于14.0%～49.8%、5.7%～21.8%和4.7%～21.4%，且隨著沖泡次數(shù)增加，遷移率逐漸降低。6種農(nóng)藥經(jīng)過(guò)3批沖泡后總遷移率在25.1%～84.6%，其中對(duì)硫磷、倍硫磷、治螟磷和滅線磷的總遷移率都大于60%；并且在第一批沖泡過(guò)程中，對(duì)硫磷和滅線磷從金銀花向茶湯遷移的比率均較高，在45%以上，也就是近一半的農(nóng)藥遷移到茶湯中；特丁硫磷和丙溴磷3批次總遷移率均低于30%。由此可見(jiàn)，在日常金銀花沖泡過(guò)程中，殘留農(nóng)藥會(huì)以一定比例遷移至茶湯中，尤其是有機(jī)磷這種水溶性較高的農(nóng)藥，遷移率相對(duì)較高，對(duì)常飲用金銀花茶湯的人群的身體健康產(chǎn)生潛在的威脅。

圖2 6種有機(jī)磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中的MRM色譜Fig.2 MRM chromatogram of 6 organophosphorus pesticides in honeysuckle and tea infusion

表4 6種有機(jī)磷農(nóng)藥在茶湯中的遷移率

2.3.2農(nóng)藥遷移模型的建立

金銀花中農(nóng)藥遷移入茶湯中取決于水溶解度(Ws)[23]、正辛醇- 水分配系數(shù)(Kow)[22-28]和金銀花的特性[29]，遷移率還與金銀花中農(nóng)藥的殘留量、沖泡溫度、沖泡時(shí)間、沖泡次數(shù)等有著密切關(guān)系。本研究參考Wang等[22]的泡茶方式，使用100 ℃沸水沖泡金銀花粉碎樣品15 min，沖泡3次計(jì)算其總遷移率。6種有機(jī)磷農(nóng)藥的Ws及Kow的對(duì)數(shù)值見(jiàn)表1，根據(jù)表1可以看出這6種有機(jī)磷農(nóng)藥極性分布廣，建立的模型適用性較強(qiáng)。通過(guò)分析農(nóng)藥遷移率與Kow及Ws之間的關(guān)系，建立了金銀花沖泡過(guò)程中有機(jī)磷農(nóng)藥的遷移模型，如圖3。通過(guò)分析lg Kow、lg Ws與lg TR之間的線性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)lg Kow與6種農(nóng)藥遷移率的關(guān)聯(lián)性較顯著，且呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)Origin 8.6擬合出線性方程lg TR=-0.536 2 lg Kow+3.915 2(lg Kow>3)，R2=0.914，見(jiàn)圖3(a)；研究也證實(shí)了lg Ws與6種農(nóng)藥遷移率未表現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián)性，見(jiàn)圖3(b)。但需要指出由于本研究6種農(nóng)藥的lg Kow均大于3，因此本預(yù)測(cè)模型只適用于lg Kow>3的有機(jī)磷農(nóng)藥，有一定的范圍要求。該遷移預(yù)測(cè)模型可以對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的潛在遷移率進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而更科學(xué)地評(píng)價(jià)金銀花的飲用風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 6種有機(jī)磷農(nóng)藥正辛醇- 水分配系數(shù)、水溶解度與遷移率的關(guān)系Fig.3 Relationship between Kow, Ws and transfer rate of 6 organophosphorus pesticides

通過(guò)農(nóng)藥遷移模型的建立，還可為日常飲茶者提供一些建議，在保證金銀花營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味的前提下，棄去第一批短時(shí)間沖泡的茶湯，再進(jìn)行第二、三批泡茶飲用，從而顯著降低茶湯中的農(nóng)藥殘留，達(dá)到“洗茶”的目的，有效降低對(duì)人類健康的威脅。

3 結(jié) 論

建立了QuEChERS-GC-MS/MS法快速測(cè)定金銀花和茶湯中6種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。通過(guò)優(yōu)選MWCNTs、PSA和無(wú)水硫酸鎂的填料組合，有效去除了金銀花基質(zhì)中的雜質(zhì)，具有較好的準(zhǔn)確性和精密度。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，適合金銀花中6種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。研究了金銀花在沖泡過(guò)程中6種有機(jī)磷農(nóng)藥的遷移規(guī)律，建立了遷移模型lg TR=-0.536 2lg Kow+3.915 2(lg Kow>3)。模型表明農(nóng)藥的遷移率與正辛醇-水分配系數(shù)具有顯著關(guān)聯(lián)性，與水溶解度無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。本研究以期為我國(guó)制定金銀花中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)，并為建立其他茶飲料(如咖啡、可可、菊花、玫瑰和香草等)的有機(jī)磷農(nóng)藥遷移模型提供一定的參考。