季修慶,林穎,王玉國(guó),周冉,李璃,劉安,周靜,王亞,胡平,許爭(zhēng)峰(南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心,南京 210004)
小額外標(biāo)記染色體(small supernumerary markerchromosome, sSMC)是指在染色體核型分析中,除正常染色體外,出現(xiàn)的不明結(jié)構(gòu)、無法辨別其來源和特征的染色體,導(dǎo)致染色體數(shù)量和基因拷貝數(shù)發(fā)生變化,其可來源于任何一條染色體,攜帶者臨床癥狀從無到嚴(yán)重畸形[1-2]。對(duì)攜帶sSMC的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前篩查和診斷明確其來源和結(jié)構(gòu)組成,對(duì)臨床遺傳咨詢非常重要。
基于高通量測(cè)序的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(non-invasive prenatal tests, NIPT)已廣泛應(yīng)用于胎兒染色體數(shù)目異常檢測(cè),近年來亦多應(yīng)用于染色體微缺失或微重復(fù)的產(chǎn)前篩查[3-4]。除了傳統(tǒng)的染色體G顯帶技術(shù),多種分子遺傳技術(shù)在sSMC胎兒產(chǎn)前診斷中廣泛應(yīng)用,如染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis, CMA)是最近發(fā)展起來的主要用于檢測(cè)染色體亞顯微缺失/微重復(fù)的一項(xiàng)技術(shù),目前已應(yīng)用于sSMC的產(chǎn)前診斷[1-2];多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的分子技術(shù),業(yè)內(nèi)已廣泛用于產(chǎn)前快速診斷胎兒染色體非整倍體異常[5],也常應(yīng)用于Y染色體微缺失檢測(cè)[6]。本研究主要探討以上技術(shù)在攜帶sSMC胎兒的產(chǎn)前篩查和診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
1.1研究對(duì)象 孕婦1,35歲,孕3產(chǎn)1,2017年6至7月于南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診,孕16+5周行NIPT檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果為18三體高風(fēng)險(xiǎn),經(jīng)過遺傳咨詢和知情同意選擇后,行羊膜腔穿刺術(shù);本次妊娠未接觸有害物質(zhì)。孕婦2,37歲,孕3產(chǎn)1,2018年3至4月于南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診,孕15+4周進(jìn)行NIPT,檢測(cè)結(jié)果為性染色體異常(47,XXY)高風(fēng)險(xiǎn),經(jīng)過遺傳咨詢和知情同意選擇后,進(jìn)行了羊膜腔穿刺術(shù),本次妊娠未接觸有害物質(zhì)。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.NFKSL-111-2019),患者及家屬知情同意。
1.2主要儀器和試劑 羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(杭州博圣生物公司);人外周血細(xì)胞培養(yǎng)基(青島萊佛生物工程研究所);基因組DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);MLPA P095染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒、MLPAP360-B1Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒(荷蘭MRC-Holland公司)。GSL-120全自動(dòng)染色體掃描系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司);3130型基因分析儀(美國(guó)ABI公司);NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)莫賽飛公司);GSL-120全自動(dòng)染色體掃描系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司);HumanCytoSNP-12 BeadChip Kits芯片(美國(guó)Illuminate公司)。
1.3方法
1.3.1胎兒羊水細(xì)胞及胎兒雙親外周血染色體G顯帶核型分析 分別采集2例孕婦羊水20 mL,按照羊水細(xì)胞核型制作實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范常規(guī)收獲細(xì)胞,染色體制片;分別取2例胎兒的雙親空腹靜脈血3 mL,經(jīng)過常規(guī)血細(xì)胞培養(yǎng)收獲和染色體制片;采用GSL-120全自動(dòng)染色體掃描系統(tǒng)對(duì)染色體玻片掃描,并用軟件對(duì)胎兒及父母的染色體核型分析,結(jié)果分析按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(2016)進(jìn)行。
1.3.2基因組DNA提取 取10 mL羊水,1 800 r/min離心10 min,取沉淀,按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取羊水細(xì)胞基因組DNA, TE溶液洗脫DNA,NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,取吸光度(A260/280 nm)為1.7~1.9的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),樣本置-80 ℃保存。
1.3.3MLPA技術(shù)檢測(cè)染色體數(shù)目異常 用MLPA P095非整倍體檢測(cè)試劑盒檢測(cè),該試劑盒內(nèi)共有36對(duì)探針,其中21、13、18、X號(hào)染色體上分別有8對(duì)探針,Y染色體上有4對(duì)探針(其中3對(duì)位于短臂,1對(duì)位于長(zhǎng)臂),通過探針檢測(cè)這些染色體的非整倍體異常和探針范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)異常。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130型基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳,結(jié)果經(jīng)GeneMapper軟件分析得出峰高、峰面積和片段長(zhǎng)度等數(shù)據(jù),計(jì)算樣本的標(biāo)準(zhǔn)化值(每條探針的峰面積/同組峰面積的平均值),并與軟件自帶的正常二倍體樣本相應(yīng)產(chǎn)物峰的標(biāo)準(zhǔn)化面積平均值進(jìn)行比較,得出的比值即該樣本DNA 拷貝數(shù),比值=1.0為正常,比值=1.5為染色體三倍體,比值=0.5為染色體單體。
1.3.4CMA檢測(cè) 選用HumanCytoSNP-12 BeadChip Kits芯片,該芯片有約30萬個(gè)檢測(cè)位點(diǎn),按照該芯片說明書對(duì)羊水基因組DNA進(jìn)行芯片雜交試驗(yàn),采用iscan掃描系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,根據(jù)探針雜交給出的熒光信號(hào)值強(qiáng)弱以及等位基因型的定性結(jié)果判斷微缺失、微重復(fù),結(jié)果采用Karyostudio 1.3.11 Build36.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢測(cè)出的拷貝數(shù)變異(copy nu×106bper variations, CNVs)根據(jù)多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(http://projects.tcag.ca /variation /) 、DECIPHER病理性數(shù)據(jù)庫(kù)(http://decipher.sanger.ac.uk/) 和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /omim) 進(jìn)行比對(duì)分析。根據(jù)檢出CNVs 的性質(zhì),按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)的指南[7],將CNVs分為4個(gè)等級(jí):臨床致病性CNVs,臨床可能致病性CNVs,臨床意義不確定性CNVs,良性CNVs。
1.3.5MLPA技術(shù)檢測(cè)Y染色體微缺失 使用P360-B1Y染色體微缺失試劑盒[包含55對(duì)探針,其中SRY基因探針1對(duì),針對(duì)Y染色體無精子因子(AZF)區(qū)域的探針:AZFa區(qū)域14對(duì)探針、AZFb區(qū)域16對(duì)探針、AZFc區(qū)域的12對(duì)探針,參考探針12對(duì)],按照試劑盒說明書操作,結(jié)果分析同1.3.3。
2.1胎兒1各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果 胎兒1的染色體非整倍體檢測(cè)結(jié)果為18號(hào)染色體短臂部分三體,位于18p11.21的MC2R-2探針和位于18p11.32的TYMS-7探針檢測(cè)出重復(fù),比值在1.5~2之間(圖1A);胎兒1的G顯帶核型為47,XY,+Mar(圖1B);胎兒1的CMA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)致病性CNVs:18號(hào)染色體p11.32p11.21區(qū)段存在14.96×106bp的拷貝數(shù)重復(fù)(4份拷貝):arr[hg19]18p11.32p11.21(136,227-15,099)×4(圖1C)。
注:A, MLPA檢測(cè)染色體非整倍體異常結(jié)果:18p11.32-p11.21區(qū)間的2個(gè)探針出現(xiàn)三倍體拷貝峰,比值在1.5~2之間(如箭頭所示);B,羊水細(xì)胞G顯帶結(jié)果:47,XY,+Mar(如箭頭所示);C,CMA檢測(cè)的結(jié)果:18p11.32-p11.21區(qū)域出現(xiàn)四倍體重復(fù)(箭頭所示)。
圖1 胎兒1的MLPA、G顯帶核型和CMA檢測(cè)結(jié)果
2.2胎兒2各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果 胎兒2的MLPA快速診斷結(jié)果為:性染色體的探針信號(hào)顯示存在2條正常X染色體及1個(gè)短臂缺失的Y染色體(圖2A);胎兒2的G顯帶核型為47,XX,+Mar(圖2B);MLPA技術(shù)檢測(cè)Y染色體微缺失結(jié)果為SRY基因和生精區(qū)AZFc區(qū)缺失(圖2C)。
注:A, MLPA檢測(cè)染色體非整倍體異常結(jié)果:以正常男性的結(jié)果為對(duì)照,顯示存在2條正常X染色體,但Yp11.31上3個(gè)探針均未顯示缺失,位于Yq11.21的1個(gè)探針有擴(kuò)增,提示Y染色體短臂缺失(箭頭所示);B,羊水細(xì)胞G顯帶結(jié)果為47,XX,+Mar(箭頭所示);C, MLPA技術(shù)檢測(cè)Y染色體微缺失結(jié)果:SRY基因探針未擴(kuò)增,位于Yq11.223上的12個(gè)探針也沒有擴(kuò)增信號(hào),即生精區(qū)AZFc區(qū)缺失(箭頭所示)。
圖2 胎兒2的MLPA、G顯帶核型和MLPA檢測(cè)Y微缺失結(jié)果
2.3胎兒雙親的外周血染色體核型結(jié)果 2例胎兒母親的外周血染色體核型均為46,XX,父親的外周血染色體核型均為46,XY,故2例胎兒標(biāo)記染色體均為新發(fā)突變。
本研究中胎兒1和胎兒2的NIPT檢測(cè)結(jié)果分別為18三體和性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn),故而進(jìn)行侵入性羊水產(chǎn)前診斷。因MLPA快速產(chǎn)前診斷試劑盒中有18號(hào)和性染色體的探針,孕婦均選擇MLPA快速診斷及羊水染色體G顯帶核型檢測(cè)。MLPA結(jié)果顯示:胎兒1短臂部分18三體,胎兒2存在2條X染色體和1條短臂缺失的Y染色體;核型結(jié)果均為sSMC攜帶者。由于MLPA技術(shù)存在探針覆蓋范圍有限等局限性,而CMA技術(shù)探針范圍覆蓋廣、能精確檢測(cè)變異的范圍,所以本研究選擇CMA技術(shù)驗(yàn)證胎兒1 MLPA檢測(cè)結(jié)果;胎兒2的快速診斷結(jié)果顯示有短臂缺失的Y染色體,因CMA技術(shù)在Y染色體上設(shè)計(jì)的探針較少,故而選擇MLPA技術(shù)檢測(cè)Y微缺失。胎兒1的CMA驗(yàn)證結(jié)果顯示18號(hào)染色體p11.32p11.21區(qū)段存在14.96×106bp的拷貝數(shù)重復(fù)(4份拷貝),為致病性CNVs[8];胎兒2驗(yàn)證結(jié)果顯示SRY基因區(qū)和生精區(qū)AZFc區(qū)缺失,結(jié)合核型結(jié)果,屬于性染色體異常綜合征;2例胎兒父母均選擇終止妊娠。
近年來隨著NIPT的測(cè)序數(shù)據(jù)量增加,信息處理算法不斷升級(jí),逐步擴(kuò)展至對(duì)染色體CNVs的檢測(cè)[3],其中測(cè)序深度是檢測(cè)微小變異的主要決定因素[9-10]。傳統(tǒng)的G顯帶核型分析可以顯示sSMC數(shù)目和形態(tài),但分辨率較低、周期長(zhǎng),且不能確定其來源;MLPA技術(shù)周期短、成本低,缺點(diǎn)是通量小,探針不能覆蓋整個(gè)基因組;CMA技術(shù)具有高通量、高分辨率、快速等優(yōu)點(diǎn),但目前成本相對(duì)較高。本研究中胎兒1的MLPA結(jié)果顯示,18號(hào)染色體的2個(gè)探針擴(kuò)增信號(hào)比值在1.5~2之間(圖1A),判讀為三倍體,而CMA結(jié)果顯示該區(qū)域的四倍體(圖1C),分析原因主要是由于MLPA技術(shù)存在局限性:其通過對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)峰信號(hào)反映探針靶序列的相對(duì)拷貝數(shù),屬于定性和半定量的分子技術(shù),而CMA技術(shù)直接根據(jù)探針雜交給出的熒光信號(hào)值強(qiáng)弱以及等位基因型的定性結(jié)果判斷微缺失、微重復(fù),能更準(zhǔn)確地檢測(cè)CNVs。
綜上所述,隨著NITP測(cè)序深度的增加,可以有效地篩查出sSMC胎兒,每一種分子遺傳診斷技術(shù)應(yīng)用于sSMC胎兒產(chǎn)前診斷都有其優(yōu)缺點(diǎn),應(yīng)與傳統(tǒng)的G顯帶核型分析相結(jié)合,各技術(shù)結(jié)果相互驗(yàn)證、互為補(bǔ)充,為臨床遺傳咨詢提供更全面和詳細(xì)的信息。