姚 武崔 朋胡曉倩

(1.黃山學院化學化工學院，安徽黃山 245041； 2.黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽黃山 245041)

1 引 言

電化學發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)是基于電極反應產物之間或電極反應產物與體系中組分之間進行化學反應，使得發(fā)光信號分子產生激發(fā)態(tài)，然后發(fā)光信號分子從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)而產生的一種光輻射，是通過電化學反應直接或間接引發(fā)的化學發(fā)光現(xiàn)象[1-2]。由于ECL分析技術是電化學分析和化學發(fā)光分析技術結合的產物，兼具二者的特點和優(yōu)勢，因此得到了國內外眾多學者的廣泛關注，相關研究和應用得到了長足的發(fā)展，特別是在檢測傳感器研究方面得到了比較廣泛的應用。

適配體(Aptamer)是通過體外篩選、指數富集的系統(tǒng)進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)獲得，可以折疊成特定三維結構，通過空間構型互補以及靜電、氫鍵等作用與靶分子特異性結合的一段單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA)[3-5]。適配體與靶分子之間的分子識別功能與抗體抗原相似，但適配體作用的靶分子范圍更廣，且具有核酸自身穩(wěn)定性強、變性復性快速可逆、易功能化修飾與標記等諸多優(yōu)點，已在生命、醫(yī)學、化學、環(huán)境等眾多領域得到應用。

近年來，人們把適配體的分子識別功能和電化學發(fā)光的信號指示功能結合起來，構建出一系列功能各異、性能優(yōu)越的電化學發(fā)光適配體型(ECL-aptamer)傳感器。該類傳感器已被廣泛研究應用于 miRNA[6]、蛋白[7-10]、酶[11-13]、毒素[14-16]、腫瘤細胞[17-20]、腫瘤壞死因子[21]、金屬離子[9，22]等的分析檢測。但該類型傳感器應用于三磷酸腺苷(ATP)的含量檢測少有報道[23-24]。ATP適配體寡核酸鏈可以顯著增強溶液中[Ru(bpy)2dppz]2+分子的ECL信號。當ATP分子與適配體作用后，[Ru(bpy)2dppz]2+分子的ECL信號明顯減弱。Xu研究組[23]借助該現(xiàn)象建立了ATP含量的檢測方法，檢測限為100 nmol/L，檢測線性范圍為0.2～1.0 μmol/L。Ju小組[24]利用 ATP適配體互補DNA和G四鏈體DNA核酸酶雙標記納米金顆粒。當ATP的量越多，能夠通過與適配體雜交連接到電極表面的納米金顆粒數量就越少，DNA核酸酶催化還原溶液中作為量子點ECL共反應物的溶解O2也越少，則電極表面量子點的ECL信號越強。據此建立的電化學發(fā)光適配體型傳感器用于ATP含量檢測，檢測限為7.6 nmol/L，檢測線性范圍為8～2 000 nmol/L。

本文在前期工作[25]的基礎上，借助納米金電極增加探針DNA(pDNA)組裝量和二茂鐵分子猝滅聯(lián)吡啶釕ECL信號，建立了一種靈敏度更高、檢測范圍更寬的電化學發(fā)光適配體型ATP檢測傳感器。兩端含6個互補堿基的單鏈pDNA，先通過3′分子端修飾的氨基標記上電化學發(fā)光信號聯(lián)吡啶釕，再利用5′端修飾的巰基自組裝到納米金電極表面。電極表面的pDNA與通過5′端修飾的氨基標記二茂鐵分子的ATP適配體雜交形成剛性線形的雙鏈DNA，從而構建出電化學發(fā)光適配體型ATP檢測傳感器。在ATP分子與適配體作用之前，傳感器表面的pDNA與互補ATP適配體呈剛性線形的雙螺旋結構，使得pDNA 3′端的聯(lián)吡啶釕分子遠離納米金電極表面，導致ECL信號較弱。同時，又由于適配體5′端標記的二茂鐵分子對聯(lián)吡啶釕分子的電化學發(fā)光具有猝滅作用，使得此時的ECL信號更弱。當ATP與適配體作用形成適配體-ATP復合物離開電極表面，而后電極表面的pDNA在高離子強度溶液中形成發(fā)夾型的莖環(huán)構象，使得ECL信號分子聯(lián)吡啶釕與金電極表面靠近，產生顯著增強的ECL信號，如示意圖(用于ATP檢測的電化學發(fā)光適配體傳感器原理圖)(a)、(b)所示。ECL信號的增強幅度與ATP濃度的對數值具有良好的線性關系，從而可以對ATP的含量進行高靈敏度的檢測，并獲得更寬的檢測范圍。如示意圖(c)所示，形成頸環(huán)結構的pDNA可以重新與ATP適配體雜交形成剛性線形的雙鏈DNA結構，使得該傳感器具有再生性能。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、ATP適配體以及與適配體互補的探針DNA(pDNA)均購于上海生工生物工程技術和服務有限公司。5′端氨基修飾的ATP核酸適配體堿基序列為5′-NH2-(CH2)6-GCA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3′，其互補的 pDNA 序列為 5′-HS-(CH2)6-GCA CCT TCC TCC GCA ATA CTC CCC CAG GTG C-(CH2)6-NH2-3′。pDNA序列的兩端為6個互補的堿基，以利于形成莖環(huán)結構的分子構象，5′端是巰基修飾，用于pDNA在納米金電極上通過 Au—S鍵進行自組裝。 二-(2，2′-聯(lián)吡啶)-4′-甲基-4-羧基聯(lián)吡啶合釕(Ⅱ)琥珀酰胺酯-二-六氟磷酸鹽(Ru(bpy)2(cbpy)NHS)購于Fluka化學試劑公司，三-(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和 2-巰基乙醇(ME)購于Alfa Aesar中國(天津)有限公司，三丙基胺(TPA)購于ACROS化學試劑公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自百靈威化學試劑公司，二茂鐵甲酸(Fc-COOH)購于江蘇威特化工廠。所有其他試劑均為分析純，未純化使用。

CHI660c型電化學工作站(上海晨華儀器公司)用于控制電極反應，BPCL-2-KIC型超微弱發(fā)光分析儀(中科院北京生物物理研究所)用于電化學發(fā)光信號采集，日立U-3010型紫外分光光度計(Hitachi，Japan)用于測定紫外-可見光譜。

2.2 探針pDNA-Ru和aptamer-Fc的合成

按照文獻[26]方法合成聯(lián)吡啶釕標記的探針DNA(pDNA-Ru)和二茂鐵標記的適配體(aptamer-Fc)，合成產物用紫外-可見光譜表征。

2.3 ECL-aptamer傳感器的構建

金電極用α-Al2O3粉拋光成鏡面后，再分別在高純水、無水乙醇、高純水中超聲清洗，然后在0.50 mmol/L的H2SO4溶液中進行循環(huán)伏安掃描，掃描電位為-0.2～1.7 V，掃速為0.1 V/s，直到出現(xiàn)典型且穩(wěn)定的金電極掃描特征曲線。取出金電極，用高純水清洗干凈，并用高純氮氣吹干。該電極再在3.0 mmol/L HAuCl4(0.10 mol/L KNO3)溶液中，在-0.2 V電位下進行恒電位電解60 s，得納米金電極。取出電極用高純水沖洗干凈后，重新在0.50 mol/L的H2SO4溶液中以相同電位范圍和掃速進行循環(huán)伏安掃描，直到出現(xiàn)典型且穩(wěn)定的金電極掃描特征曲線，取出后用高純水清洗干凈，并用高純氮氣吹干待用。

將處理干凈并吹干的納米金電極迅速插入500 μL 1.0 μmol/L 的 pDNA-Ru 溶液中，在室溫下浸泡12 h，pDNA-Ru通過金硫鍵自組裝上納米金電極表面，用10.0 mmol/L的PBS(pH＝7.4)淋洗電極表面，洗去沒有鍵合的探針pDNA-Ru。該電極再在2.0 mmol/L ME(10.0 mmol/L PBS，1.0 mol/L NaCl，pH ＝7.4)溶液中浸泡鈍化1 h，除去非特異性鍵合的pDNA-Ru和封閉沒有鍵合上探針DNA的納米金電極表面位點。該修飾電極再浸入500 μL 0.50 μmol/L 的aptamer-Fc 溶液(10.0 mmol/L PBS，0.10 mol/L NaCl，5.0 mmol/L MgCl2，pH ＝7.4)中，于 37 ℃孵化 1 h，探針 pDNA-Ru與aptamer-Fc雜交生成剛性線形的雙螺旋DNA(ds-DNA-Ru-Fc)。所得電極用10.0 mmol/L PBS(pH＝7.4)溶液淋洗后作為ECL-aptamer傳感器待用，并用循環(huán)伏安曲線和電化學阻抗譜對其進行表征。

2.4 電化學發(fā)光信號檢測

ECL-aptamer傳感器在500 μL不同濃度的ATP 溶液(10.0 mmol/L PBS，0.10 mol/L NaCl，pH＝7.4)中37℃孵化40 min后，經10.0 mmol/L PBS(pH＝7.4)緩沖溶液清洗，室溫浸泡在1.0 mol/L NaCl(10.0 mmol/L PBS，5.0 mmol/L MgCl2，pH＝7.4)溶液30 min。電極取出后用0.10 mol/L的PBS緩沖溶液淋洗電極表面，再在2.0 mL 0.10 mol/L TPA(0.10 mol/L PBS，pH ＝7.4)溶液中，于0～0.75 V電位范圍、100 mV/s掃速下進行循環(huán)伏安掃描，同時記錄電化學發(fā)光信號。

3 結果與討論

3.1 pDNA-Ru和aptamer-Fc的表征

合成的探針pDNA-Ru用紫外-可見光譜進行表征，如圖1所示。圖1中曲線a、b、c分別為探針pDNA、Ru(bpy)2(cbpy)NHS和pDNA-Ru的紫外-可見吸收光譜。插圖是pDNA-Ru在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大，其中448 nm的吸收峰與Ru(bpy)2(cbpy)NHS的452 nm吸收峰對應，是聯(lián)吡啶釕金屬離子到配體電子轉移的特征吸收帶，說明聯(lián)吡啶釕已經被標記到探針pDNA鏈上。

圖1 pDNA(a)、Ru(bpy)2(cbpy)NHS(b)和 pDNA-Ru(c)的紫外-可見吸收光譜。插圖：pDNA-Ru在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大。注：“258(0.371 6)”含義為吸收峰波長258 nm，相對于基線的吸光度值0.371 6。Fig.1 UV-Vis absorption spectra of pDNA(a)，Ru(bpy)2-(cbpy)NHS(b)and pDNA-R(c).Inset：amplification of the absorption spectrum curve of pDNA-Ru in the range of 400-500 nm.Note： “258(0.371 6)”means that the absorption peak wavelength is 258 nm，and the absorbance is 0.371 6.

合成的aptamer-Fc同樣用紫外-可見光譜進行表征，結果如圖2所示。圖2中曲線a、b、c分別為aptamer、Fc-NHS和 aptamer-Fc的紫外-可見吸收光譜。插圖是aptamer-Fc在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大，其中450 nm的吸收峰與二茂鐵琥珀酰胺酯的450 nm吸收峰對應，說明二茂鐵分子已經被標記到適配體分子上。

圖2 aptamer(a)、Fc-NHS(b)和 aptamer-Fc(c)的紫外-可見吸收光譜。插圖：aptamer-Fc在400～500 nm范圍吸收光譜曲線的放大。注：“258(0.261 4)”含義為吸收峰波長258 nm，相對于基線的吸光度值0.261 4。Fig.2 UV-Vis absorption spectra of aptamer(a)， Fc-NHS(b)and aptamer-Fc(c).Inset：amplification of the absorption spectrum curve of aptamer-Fc in the range of 400-500 nm.Note： “258(0.261 4)”means that the absorption peak wavelength is 258 nm，and the absorbance is 0.261 4.

3.2 ECL-aptamer傳感器的表征

圖3 不同階段的納米金電極在溶液中的循環(huán)伏安圖(a)和電化學阻抗圖(b)。a：裸納米金電極，b：pDNA-Ru修飾的納米金電極，c：ds-DNARu-Fc修飾的納米金電極，d：ds-DNA-Ru-Fc與ATP作用后的納米金電極。Fig.3 CV(a)and EIS(b)of the modified electrode at different stages in solution.a：bare nano-Au electrode， b： pDNA-Ru modified nano-Au electrode， c： ds-DNA-Ru-Fc modified nano-Au electrode，d：ds-DNA-Ru-Fc modified nano-Au electrode after incubation in an ATP solution.

圖3 (b)是納米金電極在不同階段的電化學阻抗曲線。納米金電極組裝探針pDNA-Ru并在ME溶液中鈍化后，電荷轉移電阻增加(圖3(b)，a和b)。當電極表面的pDNA-Ru和aptamer-Fc雜交后，電荷轉移電阻進一步增大(圖3(b)，c)。當電極在ATP溶液中孵化后，電荷轉移電阻減小(圖3(b)，d)。電荷轉移電阻的變化規(guī)律和循環(huán)伏安曲線的結果一致，進一步證明了pDNA-Ru在納米金電極表面的組裝、pDNA-Ru和aptamer-Fc的雜交、適配體從電極表面的解離等過程。

3.3 ECL-aptamer傳感器的電化學發(fā)光行為

圖4是ECL-aptamer傳感器與ATP分子作用前后ECL信號的變化過程。曲線a表明裸納米金電極沒有ECL信號產生，組裝了pDNA-Ru并在ME溶液中鈍化后，pDNA-Ru形成發(fā)夾型的莖環(huán)結構，使得聯(lián)吡啶釕分子靠近電極表面，產生很強的ECL信號(圖4，b)。該修飾電極在0.50 μmol/L aptamer-Fc溶液中37℃孵化1 h，pDNARu和aptamer-Fc雜交形成剛性線形的雙螺旋DNA鏈(ds-DNA-Ru-Fc)，由于 pDNA 3′端標記的聯(lián)吡啶釕分子遠離納米金電極表面，且適配體5′端標記的二茂鐵分子靠近聯(lián)吡啶釕分子，對聯(lián)吡啶釕的ECL信號具有猝滅作用，導致ECL信號顯著降低(圖4，c)。當ECL-aptamer傳感器浸泡在100.0 nmol/L ATP溶液中，由于ATP分子與適配體分子存在更強的相互作用，生成適配體-ATP復合物，aptamer-Fc從電極表面脫落，消除了二茂鐵分子對聯(lián)吡啶釕ECL信號的猝滅作用，導致ECL信號增強(圖4，d)。此時的ECL-aptamer傳感器再在高離子強度溶液(1.0 mol/L NaCl，10.0 mmol/L PBS，5.0 mmol/L MgCl2，pH ＝ 7.4)中作用30 min，單鏈 pDNA-Ru再次形成莖環(huán)結構，ECL信號基本恢復至與aptamer-Fc雜交之前的強度水平(圖 4，e)。

圖4 ECL-aptamer傳感器在不同階段的ECL發(fā)光曲線。a：裸納米金電極，b：pDNA-Ru修飾的納米金電極，c：ds-DNA-Ru-Fc 修飾的納米金電極，d：ds-DNA-Ru-Fc與ATP作用后的納米金電極，e：在1.0 mol/L氯化鈉溶液中孵化后的納米金電極。Fig.4 ECL profiles of the ECL-aptamer biosensor at different stages.a： bare nano-Au electrode， b： pDNA-Ru modified electrode， c： ds-DNA-Ru-Fc modified electrode； d： ds-DNA-Ru-Fc modified electrode after incubation in an ATP solution， e： resulting electrode incubated in 1.0 mol/L NaCl solution.

3.4 實驗條件優(yōu)化

實驗研究了探針pDNA-Ru自組裝時間對ECL信號的影響，結果如圖5所示。隨著自組裝時間的延長，ECL信號逐漸增強。當自組裝時間為12 h時達到最大，而組裝時間過長，反而使ECL信號明顯減弱。故實驗選用12 h作為自組裝時間。

圖5 pDNA-Ru自組裝時間對ECL強度的影響Fig.5 Dependence of the ECL intensity on the self-assembly time of pDNA-Ru

圖6 電解電位范圍對ECL強度和重復性的影響Fig.6 Dependence of the ECL intensity and reproducibility on the applied potential

實驗考察了不同電解電位范圍對ECL信號強度和重復性的影響，結果如圖6所示。電位范圍在0～0.75 V時，產生的信號較強，連續(xù)測定3次，信號強度穩(wěn)定。故實驗選用0～0.75 V的循環(huán)伏安電解電位范圍。

實驗也考察了ECL-aptamer傳感器與ATP的相互作用時間對傳感器電化學發(fā)光信號的影響，結果如圖7所示。隨著相互作用時間從10 min增加到30 min，發(fā)光信號逐漸增大。作用時間達到40 min后，發(fā)光信號基本保持穩(wěn)定。故實驗選用40 min作為相互作用時間。

圖7 ECL-aptamer傳感器與ATP的作用時間對傳感器電化學發(fā)光信號的影響Fig.7 Dependence of the ECL decreased intensity of the ECL-aptamer sensor on the interaction time with ATP

3.5 ATP的電化學發(fā)光檢測

圖8 ECL-aptamer傳感器在不同濃度ATP溶液孵化后的ECL曲線。 ATP 溶液濃度為：a ～ f：0，0.01，0.10，1.0，10.0，100.0 nmol/L。 插圖：ECL 信號強度與ATP濃度對數值之間的線性曲線。Fig.8 ECL profiles for the ECL-aptamer biosensors after incubated in ATP solutions with different concentrations.Inset：the calibration curve of the dependence of ECL intensity on the logarithm of different concentrations of ATP.The concentrations of ATP were(from a to f)0，0.01，0.10，1.0，10.0，100.0 nmol/L.

在優(yōu)化實驗條件下，與不同濃度的ATP相互作用后，ECL-aptamer傳感器會產生不同強度的電化學發(fā)光信號。如圖8所示，電化學發(fā)光信號強度隨ATP濃度的增大而增加，且與ATP濃度的對數值在10.0 pmol/L～100.0 nmol/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為IECL＝201+672.8 lgC(C單位為pmol/L)，相關系數為0.995 9，檢測限達到5.0 pmol/L。在最佳實驗條件下，可以檢測到500 μL溶液中5.0 fmol的ATP。

實驗結果表明，與相關文獻結果比較，該ECL-aptamer傳感器具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，如表1所示。

表1 不同檢測方法的線性范圍和檢測限Tab.1 Linear ranges and detection limits of different detection methods

3.6 ECL-aptamer傳感器的選擇性和再生性

為考察該ECL-aptamer傳感器對ATP的選擇性響應，進行了傳感器對CTP(ATP的類似物)的響應實驗。同樣條件下，該傳感器分別在空白溶液、0.10 nmol/L ATP、0.10 nmol/L CTP 和 0.10 nmol/L混合溶液(ATP/CTP)中的孵化，并測量ECL信號。從圖9結果中可以看出，只有ATP組分使得ECL-aptamer傳感器產生了明顯的電化學發(fā)光信號增強，說明該傳感器對ATP具有良好的選擇性。

圖9 ECL-aptamer傳感器分別在空白溶液、CTP溶液、ATP溶液和混合溶液(CTP/ATP)中孵化后的ECL信號強度比較。Fig.9 Comparison of the ECL intensity of the ECL-aptamer biosensor when incubated with blank，CTP，ATP and mixed-sample(CTP/ATP).

實驗也考察了傳感器再生使用的性能。傳感器用于檢測100.0 nmol/L ATP溶液后，用10.0 mmol/L的PBS(pH＝7.4)淋洗電極表面，再浸入500 μL 0.50 μmol/L 的 aptamer-Fc 溶液(10.0 mmol/L PBS， 0.10 mol/L NaCl， 5.0 mmol/L MgCl2，pH＝7.4)中，于37℃孵化1 h。 所得電極又重新用于100.0 nmol/L ATP溶液的檢測，ECL信號可以恢復到原來的90%。區(qū)別于其他類型的傳感器，該傳感器的再生不需要高溫過程。實驗結果表明，該傳感器具有較好的再生性能。

4 結 論

本文基于ATP適配體與ATP分子作用后可以顯著增強傳感器ECL信號的性能，利用與ATP適配體完全互補且標記聯(lián)吡啶釕的DNA作為傳感探針，適配體作為識別元件，構建了一種電化學發(fā)光適配體型傳感器。該傳感器用于ATP含量的檢測，檢測限為5.0 pmol/L，檢測線性范圍為10.0～1.0×105pmol/L，與已報道結果相比具有更低的檢測限和更寬的檢測范圍。該傳感器構建方法為其他基于適配體的電化學發(fā)光傳感器構建提供了參考。