楊步高,趙 一,韋曉菲,郁斯婕,譚家軒,王小卉

(北京郵電大學(xué)電子工程學(xué)院安全生產(chǎn)智能監(jiān)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100876)

1 引 言

氫離子對(duì)生物體的生命活動(dòng)起著重要的調(diào)控作用，一些生命現(xiàn)象的發(fā)生常伴隨著氫離子濃度的變化，因此在細(xì)胞水平等微環(huán)境中實(shí)時(shí)檢測(cè)pH變化具有重要的意義[1-2]。傳統(tǒng)的宏觀pH電化學(xué)和光纖傳感器無(wú)法精確監(jiān)測(cè)細(xì)胞等微環(huán)境的pH變化，發(fā)展分子結(jié)構(gòu)或納米量級(jí)的pH傳感器可有效實(shí)現(xiàn)微環(huán)境檢測(cè)[3-5]。在常用的pH檢測(cè)方法中，基于熒光信號(hào)變化的檢測(cè)方法具有高的靈敏度、良好的選擇性和非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，受到研究者的廣泛關(guān)注[6-8]。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種常見的pH敏感熒光染料分子，對(duì)pH值的變化能夠迅速響應(yīng)，且具有高的靈敏度[9-11]。但是熒光分子探針存在光漂白及細(xì)胞毒副作用等缺陷，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。相比于單個(gè)熒光染料分子，通過(guò)納米顆粒負(fù)載熒光染料可提高探針的穩(wěn)定性和發(fā)光強(qiáng)度[12-14]。在熒光生物分析中，熒光納米顆粒正逐漸代替熒光探針?lè)肿?，在生物?biāo)記、成像示蹤和傳感檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用[15-17]。

本文利用共沉淀法制備了封裝pH敏感染料FITC的納米顆粒(FITC-NPs)，在納米顆粒中，選擇聚苯乙烯(PS)和十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)為基質(zhì)材料，F(xiàn)ITC被封裝于顆粒內(nèi)部，顆粒外表面則包覆多聚賴氨酸殼層(PLL)。異硫氰酸熒光素的熒光強(qiáng)度隨pH增加而逐漸增強(qiáng)，基于納米傳感器的熒光信號(hào)變化能夠快速地對(duì)pH值的變化作出響應(yīng)，多聚賴氨酸的表面修飾可提高納米傳感器的生物相容性和細(xì)胞吞噬效率，將促進(jìn)納米傳感器在細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)方面的應(yīng)用。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC)、多聚賴氨酸(PLL)和聚苯乙烯(PS)購(gòu)自Sigma-Aldrich，十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)購(gòu)于瑪雅試劑，四氫呋喃(THF)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均使用去離子水。

熒光pH納米傳感器的激發(fā)和發(fā)射光譜由日立公司生產(chǎn)的F-4600熒光分光光度計(jì)測(cè)得；納米顆粒的形貌由日立JEM 1400EX透射電子顯微鏡進(jìn)行表征；利用馬爾文Nano ZS90粒度儀分析納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射粒徑(DLS)；利用日本分光株式會(huì)社V-550分光光度計(jì)測(cè)試紫外-可見吸收光譜；通過(guò)日本尼康公司生產(chǎn)的A1Rsi共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞熒光成像。

2.2 樣品的制備方法與步驟

熒光pH納米傳感器采用共沉淀法進(jìn)行制備。 首先，配置FITC(2×10-4)、PS(2×10-3)和DTS(2×10-3)的四氫呋喃(THF)溶液，待其溶解后，按照質(zhì)量比為10∶45∶45進(jìn)行混合，通過(guò)添加THF使最終樣品濃度為5×10-4；然后，在超聲振蕩的條件下，將混合溶液注入到含有0.02 mg/mL PLL的去離子水溶液(pH＝9)中，隨后避光靜置2 h后，再于去離子水中透析12 h以去除有機(jī)溶劑，即可得到熒光pH納米傳感顆粒。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光pH納米傳感器的制備與表征

利用共沉淀法制備熒光pH納米傳感器[18-19]。將異硫氰酸熒光素(FITC)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)和聚苯乙烯(PS)的混合溶液在超聲環(huán)境中注入到含有多聚賴氨酸(PLL)的水溶液中，疏水性物質(zhì)縮聚形成納米顆粒。納米顆粒的結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，F(xiàn)ITC隨機(jī)分散于納米顆粒核心部位，硅氧烷水解縮聚在納米顆粒表面形成二氧化硅殼層，吸附帶正電的多聚賴氨酸分子形成PLL包覆的納米顆粒(FITC-NPs)。納米顆粒的形貌通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行表征，如圖1(b)所示，顆粒呈球狀，具有良好的分散性。通過(guò)分析該納米顆粒溶液的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布(圖1(c))，發(fā)現(xiàn)納米顆粒的水合粒徑平均值在150 nm左右。為了分析熒光pH納米傳感器的發(fā)光特性，我們對(duì)其進(jìn)行吸收和發(fā)射光譜表征。從圖2中可以看出，F(xiàn)ITC的吸收峰在495 nm左右，發(fā)射峰位于520 nm左右，對(duì)于 FITC-NPs，其在480 nm光激發(fā)下產(chǎn)生位于520 nm處對(duì)應(yīng)于FITC的發(fā)射峰(圖3(a))，證明FITC成功摻雜于納米顆粒中，形成熒光pH納米傳感器。

圖1 (a)pH納米傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)納米傳感器的TEM圖像；(c)納米傳感器的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布。Fig.1 (a)Schematic illustration of FITC-NPs.(b)TEM images of pH nanosensors.(c)Hydrodynamic diameter of nanosensors measured by DLS.

圖2 FITC的吸收和發(fā)射光譜Fig.2 Absorption and emission spectra of FITC dissolved in THF aqueous

3.2 納米傳感器的pH響應(yīng)特性

為了研究納米傳感器的pH響應(yīng)特性，我們分析了不同pH條件下納米傳感器發(fā)光強(qiáng)度的變化。如圖3(a)所示，隨著pH值的升高，納米傳感器在520 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，這是由于FITC對(duì)pH具有高的敏感性。為進(jìn)一步分析納米傳感器的pH敏感性，利用 FITC-NPs在520 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度與不同pH的Sigmoidal擬合曲線(圖3(b))，計(jì)算得到 pKa值為6.07[20]。當(dāng)pH值由3增加到5時(shí)，納米傳感器熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)較為緩慢；pH值由5上升到7時(shí)，熒光強(qiáng)度迅速增加；而pH值大于7以后，熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)趨于緩慢。當(dāng)pH從3變到9時(shí)，熒光強(qiáng)度增大約38倍，表明該納米傳感器對(duì)pH具有良好的靈敏度。

圖3 (a)納米傳感器在不同pH環(huán)境中的發(fā)射光譜；(b)熒光強(qiáng)度在不同pH環(huán)境中的響應(yīng)擬合曲線。Fig.3 (a)Emission spectra of nanosensors at various pH concentrations.(b)Sigmoidal fitting plot of fluorescence intensity.The experiment data were calculated from Fig.3(a).

熒光pH納米傳感器的光穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)精確度具有重要影響，為分析FITC-NPs的光穩(wěn)定性，本文對(duì)比研究FITC溶于THF溶液中和摻雜于納米顆粒內(nèi)的光泄漏情況(圖4)。在480 nm光持續(xù)輻照條件下，通過(guò)光譜儀表征納米顆粒隨光照時(shí)間變化的熒光響應(yīng)。在相同輻照條件下，對(duì)比于四氫呋喃溶液中的 FITC發(fā)光強(qiáng)度，納米顆粒中FITC的發(fā)光強(qiáng)度下降較少，表明摻雜FITC的納米傳感器有較好的光穩(wěn)定性。

圖4 FITC在THF溶液中和納米顆粒中的光穩(wěn)定性Fig.4 Photobleaching of FITC in THF and NPs

為了研究熒光pH納米傳感器的可逆性，將納米傳感器交替置于pH為3和9的環(huán)境中，然后對(duì)其發(fā)射光譜變化情況進(jìn)行表征。如圖5所示，當(dāng)緩沖液的pH于3和9之間交替變化時(shí)，納米傳感器的熒光強(qiáng)度可以隨著pH值的改變而迅速恢復(fù)到原有水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該熒光pH納米傳感器具有良好的可逆性。

圖5 納米傳感器熒光強(qiáng)度對(duì)pH響應(yīng)的可逆性Fig.5 Reversibility of the responsiveness of nanosensor towards pH

3.3 熒光pH納米傳感器的生物相容性

細(xì)胞代謝過(guò)程受細(xì)胞內(nèi)pH的調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)pH的檢測(cè)可為研究單個(gè)細(xì)胞的生理和病理過(guò)程提供重要信息，pH納米傳感器的生物相容性及細(xì)胞吞噬效率是影響細(xì)胞內(nèi)pH檢測(cè)的重要因素。為驗(yàn)證FITC-NPs的生物相容性，我們通過(guò)MTT毒性檢測(cè)方法分析了FITC-NPs對(duì)細(xì)胞存活率的影響(圖6)。首先在96孔板中，將HepG2細(xì)胞以每孔8 000個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行接種；培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的 FITC-NPs分散液(5，10，15，20，25 mg/L)；孵育24 h后，每孔加入0.02 mL的MTT溶液；4 h后清除孔內(nèi)廢液，每孔加入0.15 mL DMSO，利用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在490 nm波長(zhǎng)處的光吸收值，進(jìn)而來(lái)評(píng)估細(xì)胞的相對(duì)成活數(shù)量。從圖中可以看出，未吞噬納米顆粒的HepG2細(xì)胞的存活率為100%，當(dāng)納米顆粒的濃度從5 mg/L逐漸增加至20 mg/L時(shí)，均未對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光pH納米傳感器具有良好的生物相容性。

圖6 利用MTT法檢測(cè)FITC-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性Fig.6 Viability of HepG2 cells loaded with FITC-NPs at various concentrations determined by MTT assay

細(xì)胞對(duì)納米傳感器的吞噬效率是細(xì)胞內(nèi)pH檢測(cè)的關(guān)鍵，通過(guò)共聚焦顯微鏡成像觀察FITCNPs在HepG2細(xì)胞中的分布情況。首先將HepG2細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中孵育過(guò)夜，加入含有FITC-NPs(20 mg/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；然后進(jìn)行激光共聚焦熒光成像，激發(fā)波長(zhǎng)選擇488 nm，發(fā)射光收集波段選擇520～580 nm。如圖7所示，HepG2細(xì)胞中可以檢測(cè)到FITC-NPs的綠色熒光信號(hào)，納米顆粒主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，并未進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；納米顆粒的吞噬過(guò)程主要是基于細(xì)胞的內(nèi)吞作用，位于細(xì)胞質(zhì)中的納米顆粒發(fā)光分布不均勻，可能是因?yàn)轭w粒產(chǎn)生積聚。共聚焦成像結(jié)果表明熒光pH納米傳感器具有良好的生物相容性，能夠被細(xì)胞有效吞噬，有利于細(xì)胞內(nèi)pH的檢測(cè)應(yīng)用。

圖7 負(fù)載FITC-NPs的HepG2細(xì)胞的明場(chǎng)成像(a)、共聚焦成像(b)和疊加圖(c)。Fig.7 DIC(a)，confocal fluorescence images(b)and overlay fluorescence image(c)of HepG2 cells loaded with FITC-NPs.

4 結(jié) 論

本文利用共沉淀法制備了一種新型的熒光pH納米傳感器。該納米傳感器采用異硫氰酸熒光素作為pH敏感染料分子，異硫氰酸熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度隨pH增加而上升，當(dāng)pH值從3變至9時(shí)，熒光強(qiáng)度增大約38倍，pKa值為 6.07，納米傳感器熒光信號(hào)具有良好的pH響應(yīng)靈敏度。該熒光pH納米傳感器具有小粒徑、高靈敏度、較好的光穩(wěn)定性、良好的可逆性和生物相容性。通過(guò)激光共聚焦成像表明該傳感器具有較高的細(xì)胞吞噬效率，在細(xì)胞內(nèi)pH值的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。