郝雪蓮，亢澤峰，陳水齡，劉健

年齡相關(guān)性黃斑變性 （age-related macular degeneration，AMD)，以中心性視力下降、中心暗影和視物變形為主要癥狀[1]。本病臨床上分為非新生血管型（即非滲出性或干性）以及新生血管型（即滲出性或濕性）。晚期多為嚴(yán)重型AMD，即黃斑中心區(qū)及中心凹地圖樣萎縮，或者有脈絡(luò)膜新生血管形成。其從脈絡(luò)膜向視網(wǎng)膜生長(zhǎng)，可以突破Bruch’s膜，并在視網(wǎng)膜色素上皮和（或）視網(wǎng)膜下增殖[2]。由于新生血管的高滲透性易引起黃斑區(qū)反復(fù)出血、滲出，進(jìn)而引起瘢痕機(jī)化導(dǎo)致患者喪失中心視力甚至致盲。缺氧是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達(dá)的重要刺激因素，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路是脈絡(luò)膜新生血管 （choroidal neovascularization，CNV） 形成過(guò)程中的重要通路之一，是調(diào)控VEGF高表達(dá)的主要信號(hào)通路。本病可歸屬于中醫(yī)“視直如曲”“視瞻昏渺”“視瞻有色”等病的范疇[2]。中醫(yī)治療采用活血化瘀方法比較常見(jiàn)，其中常用有丹參、紅花、三七等[3]。丹參針劑有丹參酮IIA磺酸鈉注射液，其主要成分為丹參酮IIA。本研究通過(guò)半導(dǎo)體激光532 nm倍頻Ng:YAG激光誘導(dǎo)Brown Norway（BN）大鼠眼底CNV動(dòng)物模型，觀察了中藥單體丹參酮IIA對(duì)BN大鼠視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管HIF-1α 和VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周齡雄性BN大鼠60只，SPF級(jí)，體重在180～200 g（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK （京）2018-0006。

1.1.2主要儀器 半導(dǎo)體激光532 nm倍頻Ng:YAG激光(法國(guó)Quantel Medical公司），共焦激光眼底血管造影儀（德國(guó)海德堡），BIO-RAD全自動(dòng)熒光定量PCR儀（CFX96）。

1.1.3主要試劑和藥物10%水合氯醛溶液（國(guó)藥集團(tuán)），熒光素鈉注射液 （美國(guó)Alcon），TRIzol（CWBIO），PCR試劑盒（Vazyme），丹參酮IIA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè))，雷珠單抗眼用注射液(美國(guó)諾華制藥)。

1.2 方法

1.2.1分組 將60只BN大鼠隨機(jī)分為6組，每組分10只。A組，常規(guī)飼養(yǎng)；B組，0.9%生理鹽水8 ml腹腔內(nèi)注射；C組，右眼眼內(nèi)注射雷珠單抗眼用注射液（5μl）1次；D組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/kg）；E組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（20 mg/kg）；F組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（40 mg/kg）[5]。

1.2.2造模方法 除A組外，其他組稱重全麻后剪掉胡須，復(fù)方托吡卡胺滴眼液1滴充分散大瞳孔，滴3次，鹽酸丙美卡因滴眼液、玻璃酸鈉滴眼液1滴后，固定好大鼠，鼠眼抵觸角膜并放置大?。?.8 cm×1.8 cm，厚度：0.15 mm蓋玻片觀察大鼠眼底，啟動(dòng)532 nm半導(dǎo)體激光于眼后極部距離視盤(pán)2～3 PD處光凝8～10個(gè)點(diǎn)，光斑直徑50 μm，曝光時(shí)間0.05 s，功率300 mW[4]。

1.2.3給藥方法A組，不給藥；B組，腹腔注射8ml生理鹽水；C組，腹腔麻醉BN大鼠，在右眼角鞏膜后1～2 mm之間垂直進(jìn)針，有落空感后立刻改變進(jìn)針?lè)较蚱叫杏谘圯S進(jìn)針2～3 mm，微量注樣器注入5 μl雷珠單抗；D-F組，用丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/2 ml） 和滅菌注射用水分別配制低劑量(1.25 mg/ml)、中劑量(2.5 mg/ml)和高劑量(5 mg/ml)的丹參酮IIA磺酸鈉溶液。（大鼠腹腔注射給藥容積：5～10 ml/kg）按照大鼠體重取配置好的丹參酮溶液，給予D組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/kg）；E組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（20 mg/kg）；F組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（40 mg/kg），總劑量控制在0.6～0.8 ml。

1.2.4取材麻醉BN大鼠，快速取眼球。取3 cm×3 cm無(wú)菌塑料薄膜鋪在無(wú)菌鹽水紗布上。在紗布上快速移除眼前節(jié)后夾到無(wú)菌塑料薄膜上，剪開(kāi)成四瓣，隧道刀刮下Bruch’s膜-視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體，棄鞏膜。卷起無(wú)菌塑料膜使復(fù)合體滑入1.5 ml無(wú)Nase酶EP管中，加Trizol液1 ml，置便捷式液氮罐中，收齊樣品后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 眼底造影檢查

各組隨機(jī)選取6只，分別于造模后第7 d、14 d和21 d時(shí)稱重、剪掉胡須，腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg/kg）麻醉、配置10%熒光素鈉注射液（120 mg/kg）和1.25%吲哚菁綠注射液（36 mg/kg）混合后按體重尾靜脈注射上述混合液，行早期和晚期熒光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青綠血管造影觀察（ICGA）。使用Image-Pro Plus 6.2軟件測(cè)量熒光照片平均光密度值。

1.4 RT-qPCR法檢測(cè)HIF-1α 和VEGF表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA，所用引物序列（表1）。檢測(cè)提取濃度高進(jìn)行cDNA合成。qPCR設(shè)置反應(yīng)條件：95℃×3 min→95℃×15 s→58℃×30 s，39個(gè)循環(huán)，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后開(kāi)始分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參照基因，比較對(duì)照組，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFA和ICGA表現(xiàn)

各組造模后7 d時(shí)FFA和ICGA表現(xiàn)（圖1）。造影早期可見(jiàn)點(diǎn)狀高熒光。造影中晚期見(jiàn)花環(huán)狀熒光滲漏。相應(yīng)的ICGA晚期圖片可見(jiàn)熒光充盈，光斑周邊強(qiáng)熒光，中心呈現(xiàn)弱熒光。

圖1 各組FFA和ICGA圖。1A A組FFA圖；1B A組ICGA圖；1C B組晚期FFA圖，箭頭表示花環(huán)狀熒光滲漏；1D B組晚期ICGA圖，箭頭表示熒光充盈，周邊呈強(qiáng)熒光，中心呈弱熒光；1E C組FFA圖熒光滲漏不明顯；1F C組ICGA圖，周邊熒光強(qiáng)，中心弱；1G D組FFA圖，箭頭表示造影晚期花環(huán)狀熒光滲漏；1H D組ICGA圖，箭頭表示強(qiáng)熒光滲漏點(diǎn)；1I E組早期點(diǎn)狀FFA圖；1J E組早期點(diǎn)狀熒光滲漏ICGA圖；1K E組晚期網(wǎng)狀FFA熒光滲漏；1L E組晚期網(wǎng)狀I(lǐng)CGA熒光滲漏。FFA：眼底血管熒光造影；ICGA：吲哚菁綠脈絡(luò)膜造影

2.2 CNV形成率

大鼠激光光凝后不同時(shí)間點(diǎn)各組CNV形成率如下：7 d、14 d、21 d分別為68.7%、77.3%、75.2%，7 d時(shí)CNV形成率增高，14 d時(shí)CNV形成率達(dá)高峰值，21d趨向穩(wěn)定。7 d時(shí)各組間CNV形成率比較（χ2=4.524，P=0.340）；14 d時(shí)各組間CNV形成率比較（χ2=2.814，P=0.589）；21 d時(shí)各組間CNV形成率比較（χ2=1.894，P=0.755）；7d、14d、21d比較（χ2=3.149，P=0.207）；7 d和14 d比較 （χ2=2.858，P=0.09）；7 d和21 d比較（χ2=1.564，P=0.211）；14 d和21 d比較（χ2=0.194，P=0.659），差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 激光光凝后不同時(shí)間點(diǎn)各組CNV發(fā)生率的變化

2.3 FFA熒光滲漏AOD值

熒光滲漏平均光密度值比較：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間熒光滲漏平均光密度值比較，（F7d=33.697、F14d=47.894、F21d=59.382，均P=0.000）；7 d時(shí)，模型組與雷珠單抗組（t=15.100，P=0.000）、丹參酮低劑量組（t=2.956，P=0.025）、中劑量組（t=2.760，P=0.033），與高劑量組（t=1.579，P=0.165），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雷珠單抗組與丹參酮低劑量組（t=5.170，P=0.002）、中劑量組（t=7.793，P=0.000）、高劑量組（t=11.390，P=0.000）比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹參酮3個(gè)劑量組兩兩比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），14 d、21 d各組激光斑熒光滲漏趨勢(shì)同7 d組（表3）。

表3 各組FFA熒光滲漏AOD值比較（±s）

表3 各組FFA熒光滲漏AOD值比較（±s）

注：B組模型組；C組雷珠單抗組；D組丹參酮低劑量組；E組丹參酮中劑量組；F組丹參酮高劑量組。# 同一時(shí)間點(diǎn)多組比較，P＜0.05；*與模型組（B組）比較，P＜0.05；△與雷珠單抗組（C組）比較，P＜0.05

2.4 RT-qPCR檢測(cè)VEGF、HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量

對(duì)照組目的基因與內(nèi)參GAPDH相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行校正，得到對(duì)照組目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量1時(shí)，得到模型組與各治療組目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

VEGF mRNA：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間VEGF mRNA因子相對(duì)表達(dá)量比較（F7d=40.775、F14d=17.223、F21d=20.591，均P=0.000）；其中21 d時(shí)，模型組與雷珠單抗組（t=10.940，P=0.000）、丹參酮低劑量組（t=6.525，t=0.003）比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雷珠單抗組與丹參酮低劑量組（t=4.883，P=0.008）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹參酮低劑量組與中劑量組、高劑量組與中劑量組、高劑量組與低劑量組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表4）。

HIF-1α mRNA：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間HIF-1α mRNA因子相對(duì)表達(dá)量比較（F7d=19.544，F(xiàn)14d=221.593、F21d=67.754，均P=0.000）；7 d、14 d、21 d時(shí)各組間HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)相似，與上述VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量21 d時(shí)趨勢(shì)一致（表4）。

表4 RT-qPCR檢測(cè)VEGF、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

脈絡(luò)膜新生血管（CNV）是源自脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的增殖性血管，也是眼底新生血管的主要表現(xiàn)形式之一。CNV是多種缺血缺氧性眼底疾病的共同終末病理環(huán)節(jié)，如年齡相關(guān)性黃斑變性、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（central exudative chorioretinopathy，CEC）、病理性近視（pathological myopia，PM）等，因其病理性血管管壁的高度通透性，極易導(dǎo)致局部出血和滲出產(chǎn)生，繼而引起組織機(jī)化和瘢痕形成，是目前嚴(yán)重影響老年和青年人群不可逆性視力嚴(yán)重?fù)p害及致盲的主要原因[6]。

目前，普遍認(rèn)為局部組織缺氧和炎癥反應(yīng)的發(fā)生是脈絡(luò)膜新生血管CNV形成的主要原因，其中缺氧環(huán)境是其形成的啟動(dòng)因素，低氧環(huán)境誘發(fā)的缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)促發(fā)的相關(guān)信號(hào)通路[7]的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是最終導(dǎo)致CNV形成的核心通路之一。HIF-1由HIF-1α 和HIF-1β 兩個(gè)亞基組成，HIF-1α 是功能亞基，調(diào)節(jié)HIF-1的活性及功能，而HIF-1β 可能與HIF-1的穩(wěn)定及其二聚體形成有關(guān)聯(lián)。常氧條件下，HIF-1α 發(fā)生羥基化，隨后被胞質(zhì)中的蛋白水解酶水解成為小分子片段，失去其生物學(xué)功能；然而缺氧環(huán)境中可以誘導(dǎo)HIF-1α 的表達(dá)，過(guò)度表達(dá)的HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子HIF-1，HIF-1與VEGF基因的5’ 端和3’ 端結(jié)合，誘導(dǎo)VEGF基因的表達(dá)，促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖和遷移，促使新生血管形成[8]。近年研究顯示HIF-1α 介導(dǎo)的血管新生可能受其上游AKT途徑的調(diào)節(jié)[9]，AKT在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）條件下磷酸化，形成具有活性功能的AKT激酶，進(jìn)一步激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，進(jìn)而刺激HIF-1α 的表達(dá)，在調(diào)控VEGF表達(dá)、脈絡(luò)膜新生血管CNV形成的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

VEGF是已知促進(jìn)CNV生成的最關(guān)鍵因子，VEGFs(VEGF家族及其受體)通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂與遷徙，誘導(dǎo)毛細(xì)血管形成來(lái)促進(jìn)新生血管的生成[10]。在缺氧等條件誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)增加時(shí)，其靶基因表達(dá)量也明顯增加[11-12]。

通過(guò)抑制VEGF在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的新生血管生成作用來(lái)減輕濕性AMD癥狀的有效方法是玻璃體腔內(nèi)注射VEGF抗體。然而，由于注射的高成本和侵入性，這種治療并不總是負(fù)擔(dān)得起的。亢澤峰等應(yīng)用加減駐景方治療缺血性眼病進(jìn)行了大量體外研究[13-14]、體內(nèi)研究[15-17]、臨床觀察[18-19]和理論闡述[20]，證明了加減駐景方對(duì)VEGF因子的抑制作用。加減駐景方臨床上用其治療缺血眼病取得了良好療效，能有效改善眼底病變，提高部分視功能。方中加減藥丹參有活血化瘀，增加血、氧供應(yīng)之功效。丹參主要成分為丹參酮IIA，丹參酮IIA能明顯抑制腫瘤新生血管生成，減少VEGF產(chǎn)生[21-23]。其機(jī)制可能是通過(guò)降低HIF-1和NF-κB信號(hào)通路活化而引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)?；诖朔N假說(shuō)課題組擬以動(dòng)物模型為研究載體，從分子免疫、基因研究揭示中藥單體丹參酮IIA對(duì)CNV的作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為優(yōu)化復(fù)方、新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選用氪激光光凝眼底誘導(dǎo)BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型作為研究對(duì)象，源于大鼠誘導(dǎo)的CNV發(fā)生率較高，大約為60%～70%，在光凝后短時(shí)間內(nèi)（1周內(nèi)）即可發(fā)生，而且光凝斑的熒光滲漏在10～14 d達(dá)到高峰，便于進(jìn)行干預(yù)性研究；本次研究發(fā)現(xiàn)7 d、14 d、21 d各組大鼠激光光凝后CNV形成率分別為68.7%、77.3%、75.2%，表現(xiàn)出7 d CNV形成率明顯升高，14 d達(dá)到頂峰，21 d趨于平穩(wěn)。此方法誘導(dǎo)CNV技術(shù)比較成熟穩(wěn)定，且誘導(dǎo)CNV的條件可標(biāo)準(zhǔn)化，價(jià)格相對(duì)便宜，便于基因操作，可用于觀察單一基因過(guò)表達(dá)或高表達(dá)對(duì)CNV形成的影響[24]。

在各時(shí)間點(diǎn)，雷珠單抗能有效的抑制VEGF和HIF-1α 蛋白表達(dá)，且作用優(yōu)于中藥單體（丹參酮IIA）組。但是中藥單體組不同劑量在一定的程度上可抑制VEGF和HIF-1α 蛋白的表達(dá)，從而抑制CNV動(dòng)物模型的CNV形成。但是抑制VEGF和HIF-1α程度不隨中藥單體劑量增加而降低。

綜上所述，中藥單體丹參酮IIA磺酸鈉注射液可有效抑制CNV動(dòng)物模型視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜中VEGF和HIF-1α 蛋白表達(dá)，從而減少CNV，具有廉價(jià)，副作用少，給藥方式安全，依從性高等優(yōu)點(diǎn)。