鄭柳青,劉冬梅,張馨月,周欽育,黃燕燕,許喜林

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

近年來(lái),隨著人們對(duì)健康越來(lái)越重視,乳酸菌的益生功能也受到了人們的廣泛關(guān)注。乳酸菌可以調(diào)節(jié)人體腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)平衡[1],降膽固醇[2],增強(qiáng)免疫力[3],提高機(jī)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)因子的吸收和利用率[4]。鼠李糖乳桿菌大量應(yīng)用于發(fā)酵制品工業(yè),是目前研究最廣泛和深入的乳酸菌之一。鼠李糖乳桿菌在宿主患急性胃腸炎期間仍能促進(jìn)腸道菌群的平衡,并能在宿主體內(nèi)定殖[5]。Kamal等[6]將鼠李糖乳桿菌添加到人工污染樣本的酸奶中,可減少致病菌數(shù)量甚至完全消除致病菌。

外源益生菌的生長(zhǎng)環(huán)境與胃腸道環(huán)境相差很大,很多益生菌對(duì)胃腸道環(huán)境不耐受,因此許多學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該從人體自身的胃腸道中篩選有潛在應(yīng)用價(jià)值的益生菌。Bin等[7]從人腸道中篩選出11株乳酸菌并進(jìn)行菌株的益生性研究,這些菌株大多能較好的耐受胃腸道環(huán)境。Junjie等[8]的研究證明人源益生菌和人體腸道菌群之間有著特異選擇的關(guān)系。阿依米熱·毛拉木等[9]從新疆喀什地區(qū)的長(zhǎng)壽老人腸道中分離篩選出具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力的乳酸菌,為人源益生菌的開(kāi)發(fā)利用提供了新的菌種來(lái)源。

目前市場(chǎng)上較為著名的益生菌株如BB12、LGG都來(lái)源于國(guó)外,國(guó)內(nèi)對(duì)本土益生菌株開(kāi)發(fā)和利用尚不足。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從廣州一月齡嬰兒糞便中分離出的乳桿菌進(jìn)行生理生化特征和生物學(xué)鑒定,并對(duì)LR-ZB1107-01進(jìn)行了體外安全性評(píng)價(jià),主要包括溶血性實(shí)驗(yàn)、抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)其代謝產(chǎn)物的抑菌性、人工胃腸液耐受性、腸道黏附性、疏水性以及自聚性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)并與鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LactobacillusrhamnosusZB1107-01 本課題組從嬰兒糞便中篩選獲得,于2019年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏編號(hào)為CGMCC NO. 5172;雌雄各半的健康成年SPF級(jí)KM小鼠20只 由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、單增李斯特菌CMCC(B)54002 由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室保存;基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;葡萄糖、蔗糖、吲哚、過(guò)氧化氫 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;哥倫比亞血瓊脂平板 廣州卯林試劑有限公司;Caco-2細(xì)胞、MEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 豐暉生物科技有限公司。

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司;GI36TW型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微(廈門(mén))儀器有限公司;LHS-80型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海百典儀器設(shè)備有限公司;TCS-SP2倒置顯微鏡 德國(guó)Leica公司;3543型CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的鑒定

1.2.1.1 形態(tài)學(xué)分析 取分離純化后的單菌落涂片,進(jìn)行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征。

1.2.1.2 生理生化特征分析 參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第 8 版)[10]進(jìn)行。

1.2.1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 參照參考文獻(xiàn)提取DNA[11],取菌懸液1.0 mL,12000 r/min離心1 min,棄上清液,沉淀懸于0.6 mL溶菌酶溶液中,顛倒混勻后置于37 ℃下恒溫40 min。用試劑盒提取菌株的基因組DNA;利用模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增后用凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性,切膠回收純化后PCR產(chǎn)物送廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)菌株的基因組序列進(jìn)行同源性對(duì)比,鑒定菌株。16S rDNA引物及序列如下:27F:AGA GTT TGA TCC TGG TCA;1492R:GGT TAC CTT GTT ACG ACT T。

1.2.2 菌株的安全性評(píng)價(jià)

1.2.2.1 菌株的溶血性檢測(cè) 將活化好的LR-ZB1107-01以及質(zhì)控菌株大腸桿菌用滅菌的接菌環(huán)劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板中,于37 ℃培養(yǎng)48 h,同時(shí)做空白試驗(yàn),觀察菌落周?chē)袩o(wú)溶血圈出現(xiàn)。

1.2.2.2 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn) 參照張丹青[12]的實(shí)驗(yàn)方法,將活化后的鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01菌液均勻涂布在MRS固體培養(yǎng)基表面,將浸泡有四環(huán)素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、氨芐西林(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)的紙片置于已凝固的培養(yǎng)基上,每組抗生素紙片做3個(gè)重復(fù),37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察并測(cè)量抗生素紙片周?chē)霈F(xiàn)的透明圈。

1.2.2.3 動(dòng)物經(jīng)口急性毒理試驗(yàn) 選用18～22 g的健康成年SPF級(jí)KM小鼠20只,雌雄各半。將處于生長(zhǎng)期的待測(cè)菌株用PBS緩沖液將濃度調(diào)整至1×108CFU/mL,空腹灌胃一次,每次灌胃容量為20.0 mL/kg體重。灌胃后立即觀察其活動(dòng)表現(xiàn)、體重以及身體狀況變化,觀察期為14 d。

1.2.3 菌株的益生特性研究

1.2.3.1 抑菌活性 采用牛津杯法來(lái)測(cè)定LR-ZB1107-01代謝產(chǎn)物的抑菌性,金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌作為指示菌株,指示菌(約108CFU/mL)涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面,將無(wú)菌牛津杯平行放置于平板中,在牛津杯中加入200 μL 待測(cè)樣品,緩慢將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h,觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小。用上述相同的方法測(cè)定鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469的抑菌特性。

1.2.3.2 胃腸液耐受性 參考Strompfovád等[13]的方法,略有修改。活化后的LR-ZB1107-01菌液按照5%(v/v)的接種量,分別接種于pH=2、2.5、3、4的人工模擬胃液中,同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水作為空白組,37 ℃培養(yǎng),在0、1、2、3 h取樣,計(jì)活菌數(shù)(CFU/mL)。菌液按照5%(v/v)的接種量接種于人工腸液中,同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水為空白組,37 ℃培養(yǎng),在0、2、4、6、8 h取樣,計(jì)活菌數(shù)(CFU/mL)。鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469在上述相同條件下進(jìn)行人工模擬胃液、腸液實(shí)驗(yàn)。菌落計(jì)數(shù)方法參考GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.2.3.3 腸道黏附性 Caco-2細(xì)胞傳代培養(yǎng)2～3次后,將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×105個(gè)/每孔,傳代至24孔板中進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。調(diào)整LR-ZB1107-01濃度為1×107CFU/mL,PBS清洗2～3次24孔板,每孔加入1 mL菌液,37 ℃培養(yǎng)90 min進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。黏附完成后,PBS清洗未黏附的細(xì)胞,再加入1 mL無(wú)菌蒸餾水孵育60 min進(jìn)行細(xì)胞裂解,將每孔中剩余的菌懸液吸出計(jì)數(shù),每組3個(gè)平行,計(jì)算鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01與Caco-2細(xì)胞的黏附情況,以平均每個(gè)細(xì)胞黏附的鼠李糖乳桿菌數(shù)來(lái)判斷其黏附強(qiáng)度,上述相同方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469與Caco-2細(xì)胞的黏附情況。

1.2.3.4 菌株疏水性和自聚力測(cè)定 根據(jù)Sabdshkumar等[14]的方法,略作修改。菌株過(guò)夜培養(yǎng),5000 r/min下離心10 min,收集菌體沉淀,無(wú)菌PBS緩沖液洗滌菌體兩次后,重懸于無(wú)菌PBS中,調(diào)節(jié)OD600=0.60±0.05(A0)。取2 mL菌懸液和2 mL二甲苯充分振蕩混勻,室溫靜置30 min。小心吸取水相,以無(wú)菌PBS為空白測(cè)定OD600值(A1)。表面疏水性(%)=(1-A1/A0)×100。自聚力測(cè)定參考Todorov等[15]的方法,稍加修改。菌懸液制備同疏水性實(shí)驗(yàn),取4 mL菌懸液,室溫下靜置24 h,小心吸取上層1 mL,測(cè)量OD600(A24)值。自聚力(%)=(1-A24/A0)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)處理3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(M±SD)。采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)間的分析方法采用單因素方差分析,顯著水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)分析 分離得到的菌株革蘭氏染色后顯微照片如圖1,菌株在MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h后,菌落表面光滑有光澤,邊緣整齊,橢圓形或圓形。

圖1 LR-ZB1107-01革蘭氏染色鏡檢Fig.1 Gram staining micrograph of LR-ZB1107-01

2.1.2 生理生化特征分析 菌株的生理生化特征鑒定結(jié)果如表1所示,根據(jù)糖發(fā)酵及生理生化鑒定結(jié)果,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版[10],可初步鑒定該菌株為鼠李糖乳桿菌。

表1 LR-ZB1107-01的生化特征及碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemistry features and results of carbohydrate tests of LR-ZB1107-01

2.1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 16S rDNA序列與GenBank中菌株進(jìn)行同源性比較,結(jié)果表明該菌株與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC53103同源性最高,達(dá)100%。于2019年4月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,簡(jiǎn)稱CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCC NO. 5172,將其命名為L(zhǎng)R-ZB1107-01。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2。

圖2 LR-ZB1107-01系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of LR-ZB1107-01

2.2 安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 菌株的溶血活性檢測(cè) 溶血是指在溶血毒素及其他理化因素的作用下,紅細(xì)胞破裂,血紅蛋白逸出[16]。菌株代謝產(chǎn)物有無(wú)溶血活性被認(rèn)為是菌株安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。如圖3所示,a為鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01,周?chē)鸁o(wú)明顯溶血圈形成,屬于沒(méi)有毒性的γ-溶血,b為陽(yáng)性對(duì)照大腸桿菌,屬于β-溶血組。

圖3 溶血活性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The results of hemolytic activity test

2.2.2 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 K-B紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2,幾種常見(jiàn)的抗生素對(duì)鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01有較強(qiáng)的抑制作用,結(jié)果根據(jù)表3判斷。供試菌株對(duì)各種抗生素的抗性依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[17]制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判斷。

表2 K-B紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 K-B paper diffusion test results

表3 藥敏紙片含藥量及抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Drug sensitive paper containing drug content and resistance to determine the standard

2.2.3 動(dòng)物急性毒性試驗(yàn) 在觀察期內(nèi)小鼠的活動(dòng)、食欲正常,體重增加;試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)存活動(dòng)物解剖,肉眼未見(jiàn)心肝脾肺腎腸等內(nèi)臟器官異常。實(shí)驗(yàn)菌株LR-ZB1107-01對(duì)小鼠不具有急性毒性作用。

2.3 菌株的益生性研究

2.3.1 抑菌活性 乳酸菌的代謝產(chǎn)物在一定程度上可以抑制致病菌的增長(zhǎng)[18],本實(shí)驗(yàn)選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌作為指示菌株,抑菌結(jié)果如表4所示,兩株鼠李糖乳桿菌對(duì)三種指示菌株均有一定的抑制作用,抑菌圈直徑均超過(guò)2 cm,其中LR-ZB1107-01對(duì)大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制作用稍強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株。周鮮嬌等[19]對(duì)分離自發(fā)酵酸菜中的鼠李糖乳桿菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定,7株鼠李糖乳桿菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在2～3 cm之間。

表4 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469對(duì)四種指示菌的抑菌能力對(duì)比(cm)Table 4 The antibacterial ability of Lactobacillus rhamnosus ZB1107-01 and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(cm)

2.3.2 胃腸道耐受性 為在人體腸道內(nèi)定殖并發(fā)揮其益生性能,鼠李糖乳桿菌需具有耐受胃腸道環(huán)境的能力。如圖4(a)結(jié)果所示,LR-ZB1107-01在不同pH的人工胃液下存活狀態(tài)良好,活菌數(shù)變化與其空白組比較沒(méi)有顯著差異(P<0.05),在pH=2的胃液中暴露3 h后存活率仍高于99%。圖4(b)結(jié)果顯示鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在pH=2的胃液中暴露3 h后活菌數(shù)下降明顯,耐受性低于LR-ZB1107-01。王玉華等[20]從嬰兒糞便中篩選出的鼠李糖乳桿菌在pH=2的人工胃液環(huán)境中培養(yǎng)4 h后存活率約為57%。如圖5所示,LR-ZB1107-01和鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469均對(duì)人工腸液的耐受性較好,且LR-ZB1107-01在人工腸液中隨著時(shí)間的延長(zhǎng),活菌數(shù)略有增加。

圖4 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01(a)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469(b)對(duì)人工胃液耐受能力對(duì)比Fig.4 The survivability in artificial gastric ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

圖5 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01(a)和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469(b)對(duì)人工腸液耐受能力對(duì)比Fig.5 The survivability in artificial intestinal fluid ofLactobacillus rhamnosus ZB1107-01(a)and Lactobacillus rhamnosus ATCC7469(b)

2.3.3 腸道黏附性 黏附是鼠李糖乳桿菌與宿主腸道相互作用的第一步,是益生菌株在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功能從而調(diào)節(jié)腸道菌群健康的一個(gè)必要條件。Caco-2細(xì)胞模型是一種人克隆結(jié)腸癌細(xì)胞,結(jié)構(gòu)和功能與分化后的小腸上皮細(xì)胞相似,可以模擬人腸道中的環(huán)境[21]。結(jié)果表明,LR-ZB1107-01可有效黏附于Caco-2細(xì)胞,平均黏附數(shù)為(13.3±3.2)個(gè)/細(xì)胞,標(biāo)準(zhǔn)菌株的黏附數(shù)為(12.8±2.4)個(gè)/細(xì)胞。薛銀剛[22]從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的若干株乳酸菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附均值為10～19個(gè)/細(xì)胞。陳佩等[23]研究一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附值約為10個(gè)/細(xì)胞。

2.3.4 菌株的疏水性和自聚力檢測(cè) 細(xì)菌的疏水性和自聚性是益生菌對(duì)腸道非特異性黏附的重要指標(biāo)[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,LR-ZB1107-01的疏水性高于鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,達(dá)48.6%。兩株菌的自聚力相差不大,均超過(guò)85%。熊世進(jìn)等[25]測(cè)定人源鼠李糖乳桿菌MP-108的疏水性達(dá)90.10%,自聚力達(dá)51.54%,略高于LR-ZB1107-01。

表5 鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469的疏水性及自聚性能力對(duì)比Table 5 The ability of hydrophobicity and self-aggregation ofLR-ZB1107-01 and ATCC7469

從廣州1月齡健康的嬰兒糞便中分離出一株乳酸菌,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析以及生物學(xué)鑒定,可確定該菌株為鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusZB1107-01)。對(duì)鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià),結(jié)果表明該菌株不溶血,對(duì)抗生素敏感,動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無(wú)毒,該菌株安全。益生特性研究將LR-ZB1107-01與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7469進(jìn)行對(duì)比,LR-ZB1107-01可有效抑制三種致病菌,對(duì)大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制效果略強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株。LR-ZB1107-01對(duì)胃腸道環(huán)境高度耐受,表現(xiàn)出對(duì)酸(pH2)的強(qiáng)耐受性。自聚性和對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性與標(biāo)準(zhǔn)菌株相當(dāng),疏水性能遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)菌株。本研究篩選出具有潛在利用價(jià)值的益生菌,豐富了我國(guó)的乳酸菌資源庫(kù),為開(kāi)發(fā)新的乳酸菌產(chǎn)品創(chuàng)造條件,也為該菌在益生菌發(fā)酵工業(yè)的進(jìn)一步利用提供了理論基礎(chǔ)。